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用户之声|利用层浪流式细胞仪检测大肠杆菌活力和计数

北京层浪生物科技有限公司

2023/12/28 13:23:53

在微生物研究,尤其是细菌学中,对菌体计数是一项最基本的需求。常规的计数方法主要是国家标准推荐的平板计数法和显微镜计数法,但它们耗时长、误差大,且平板法只能计数活菌。

近年来,随着荧光染料、结构光学和流式细胞仪技术的不断发展,流式细胞术检测细菌等微生物成为可能。与传统检测方法相比,其具有灵敏、快速、高效、精确的优势,流式细胞术已经成为微生物研究中的一个重要工具,在单细胞层面对细菌结构和功能的多项参数进行更深层的分析,以研究细菌的异质性和鉴定细菌种属。

本方案以大肠杆菌为例,介绍层浪流式细胞仪如何评估活菌比例和计数。

——实验背景——

膜的完整性评估是细菌活力的重要评价手段,通常使用膜渗透性和非渗透性荧光染料来进行活力测试,目前比较常见的染料是SYTO 9/PI。

SYTO 9 作为一种可渗透的绿色荧光核酸染料,被动扩散进入细胞内,既可以进入细胞膜完整的细菌中,也可以进入细胞膜受损的细菌中,与核酸染料结合。而红色荧光核酸染料PI只能进入不完整细胞膜的细菌中。当SYTO 9和PI同时加的时候,PI染料进入膜内,会导致SYTO 9荧光染料的降低。因此,具有完整细胞膜的细菌呈现绿色,而膜不完整的细菌呈现红色。


图1:SYTO 9/PI细菌活力测定法原理示意图

——样本处理——

1. 收集对数生长期的大肠杆菌,10000g,5min,离心洗涤,取细胞沉淀重悬于0.22um过滤的无菌PBS中;

2.进行细菌计数,为后续染色做准备;

3. 取4个流式管,标记为空白组,SYTO 9和PI单染组,样本组。每个试管加100ul细菌悬液,保证细菌数在106-107左右。

——样本染色——

1. 根据厂家试剂盒建议,单染组分别加1ul SYTO 9或1ul PI,样本组加1ul SYTO 9和1ul PI,加PBS至988ul。涡旋,室温避光孵育15min;

2. 充分涡旋微球,每管分别加10ul,每份样本中体系为1000ul;

3. 设置参数,用层浪FongCyte流式细胞仪采集信号,SYTO 9(Max Ex/Em=485/498nm)用FITC通道检测,PI(Max Ex/Em=535/617nm)用PerCP通道检测,两个通道光谱重叠小,补偿易调节。

——数据分析——

1. 细菌比较小,选择对数模式分析。设置合适的电压,使细菌群信号在流式图中间清晰地呈现。设置合适的阈值,很大程度减少背景噪音。此实验中,设置的是FSC和FITC双阈值;

2. 根据FSC和SSC,圈出主细菌,右上角的一群是微球(图2);

3. 从主细菌中,选择SYTO 9和PI,红光区域的代表死菌,绿光区域的代表活菌(图3)。

——总结——

1. 原核生物平均直径在1um左右,需要挑选合适的流式细胞仪。层浪的流式细胞仪检测直径在0.1-50um,除大肠杆菌外,还可以检测葡萄球菌、酵母、浮游生物、益生菌等;

2. 层浪流式细胞仪可以获得体积法绝dui计数,跟微球法结果有较高的一致性,节约实验经费;

3. 细菌活力染色实验对管路的洁净度要求高,层浪流式细胞仪每管样本间采样针自动清洗,携带污染率为0.05%,能够获得更加准确的结果。


数据来源 : 广州某实验室

层浪: 您好,可以采访下您近期使用层浪流式细胞仪的感受吗?

客户: 可以的。

层浪:  在层浪的仪器上,您们日常都做哪些样本?

客户:  我们实验室开展多种流式实验,在微生物方面,除了细菌,还做酵母、益生菌检测等。

层浪:  您对于层浪的仪器,有哪些使用感受和反馈吗?

客户:  我们之前用平板法培养细菌进行计数,这种方式只能培养活菌,通常耗时3天左右,而流式细胞术对活菌和死菌都可以计数,比平板法的计数结果会高一些,更准确一些,而且灵敏、检测速度快、时间短,极大地提高了我们出数据的效率,我们现在逐渐用流式替代平板法了。

层浪:  确实,现在流式细胞仪在微生物研究中的作用越来越广泛了。


客户:  我们实验室之前有一款进口的流式细胞仪,现在使用贵司的仪器,非常喜欢您们的软件!中文的界面,功能键直观,而且操作简单。细菌实验对仪器的清洁度要求高,还要避免管路之间的交叉污染,之前我们是上完一个样本,再上一管水,进行反冲。而您们的仪器每个样本之间能够进行采样针清洗,免去了我们每管样本手动清洗的麻烦。做普通清洗和深度清洗也很方便,使用的清洗液用量也不大。

层浪:  非常感谢您的反馈。层浪会继续努力,用心服务每一位客户。


图4:层浪生物FongCyte™3光14色流式细胞仪

参考文献:

1、刘新星,霍转转.流式细胞术在细菌快速检测中的应用;微生物学通报。DOI:10.13344/j.microbiol.China.130041.

2、邓颖,基于流式细胞术的SYTO 9/PI细菌活性判定方法优化及其机理;暨南大学硕士学位论文.

3、Philipp Stiefel, Sabrina Schmidt-Emrich,Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.DOI 10.1186/s12866-015-0376-x.

4、S M Stocks,Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight.doi: 10.1002/cyto.a.20069.

5、Martin G. Wilkinson,Flow cytometry as a potential method of measuring bacterial viability in probiotic products: A review.//doi.org/10.1016/j.tifs.2018.05.006.




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