用于人血清中抗精子表面抗原自身抗体体外定量检测的酶免试剂盒。
1、说明
在西方国家，不孕夫妇的比例占总人群的10-15%（Haas et al，1980）。目前人们还不能的知道由免疫学因素导致不孕的发病率是多少。由于有很多不同的检测方法，人们对抗精子抗体在不孕中的作用存在着很大争议。在检测抗精子抗体的传统检测方法中，精子凝集检测和精子固定检测已被广泛应用。这些方法及其它凝集检测都很耗费时间，并且结果与其操作不协调。与传统的检测方法相比，用ELISA检测抗精子抗体具有很多优点。IBL公司的抗精子抗体ELISA试剂盒结合这些优点，并同时还具有高灵敏度和高特异性的特点。此试剂盒操作简单，并且可以检测很多种血清。
注意：此实验的附加信息可从IBL（http://www.IBL-Hamburg.com）上获取，或直接向汉堡IBL公司索取。
2、实验原理
IBL公司的精子抗体酶免试剂盒提供了人血清和精液中抗精子表面抗原抗体定量检测所需要的实验材料。
此检测试剂盒利用的是非竞争性的原理。包被在包被板微孔中的精子表面抗原是从池子中提取到的，它采用的方法是Alexander在1984年所提及到的那种方法。将疑似免疫学不孕病人的血清（已稀释好）加入到包被孔中温育，之后洗板，再加入过氧酶标记的抗人免疫球蛋白（IgA，IgG和IgM）并温育。温育后洗板，再加入TMB底物液，并酶标仪检测所显示的颜色强度。微孔中所显示的颜色强度与结合的免疫球蛋白浓度成正比。实验结果可从标准曲线上读取，结果单位为units/ml。
3、注意事项和预防措施：
1） 试剂仅供体外诊断和专业人士使用。
2） 试剂盒所中有害物质的信息请见材料安全数据单。
3） 试剂盒中的所有试剂包括检测过的人血清/血浆对HIV/II，HbsAg和HCV都表现为阴性，但是试剂中会出现此类病毒（HIV/II，HbsAg和HCV）或其他具有感染性的病原体的可能性都不能*被排除。因此，所有的试剂在使用和处理的过程中都应当作潜在生物有害物质进行处理。
4） 请不要用嘴吹试剂，不要将试剂和样品接触皮肤和黏膜。
5） 样本和试剂盒试剂处理场所，请勿吸烟、饮食和使用化妆品。
6） 处理样品和试剂时请戴橡胶手套，微生物污染的试剂和样品会导致错误的实验结果。
7） 按照相应的国家生物安全管理条理*的方法处理样品和试剂。
8） 请勿使用过期试剂
9） 按照说明书中所规定的体积（加样体积和预处理步骤）进行实验操作。使用校准的移液器时才可以得到理想的实验结果。
10） 按照国家生物安全管理条理，实验中的化学物质和所使用或准备的试剂应当当作有害废物处理。
11） 产品的材料安全数据能够从IBL公司主页上载可直接咨询IBL公司获取。安全数据单符合下列标准：EU-Guideline 91/155 EWG， ANSI-Standard，ISO-Sstandard 11014，OSHA（US）。
4、试剂盒组成
4.1试剂盒成分
试剂瓶上标出的量都是理论体积，所有的试剂瓶都装满了试剂。成分低于250μl的溶液，请注意：所有的溶液都在试剂瓶的底部。
4.1.1包被板，12×8孔，微孔中包被了精子表面抗原。
4.1.2标准品，3支，冻干粉，将每支冻干粉溶解于1ml的洗涤液中。重新配制好的标准品（标准品S5）100μl内含500mU抗精子抗体。
4.1.3酶联物，601倍浓缩，1支，100μl，内含过氧酶标记的抗人IgG、IgA、IgM，使用前用稀释液按1：601的比例进行稀释。
4.1.4 TMB底物液，1瓶，10ml，即用，内含TMB及稳定剂。
4.1.5 TMB终止液，1瓶，10ml，即用，内含1M的H2SO4，注意：避免皮肤接触。
4.1.6洗涤液，20倍浓缩，1瓶，50ml，用双蒸水按1：20的比例稀释，配置好的洗涤液在2-8℃的环境下可稳定存放4周。
4.1.7稀释液，3瓶，冻干，每瓶用20ml洗涤液稀释，配置好的稀释液在2-8℃的环境下可稳定存放2天，如果冻存于-20℃的环境下则可存放更长时间。
4.1.8质控血清，3支，冻干，每支用1ml的洗涤液稀释。质控血清应在每次实验时临时配置，并且仅能使用一次。质控血清的可接受范围请见质量质控单。
4.1.9封板纸，5片
4.10实验所需器材但试剂盒不提供
1）校准的精密移液器及取样吸头：0-20μl，10-100μl，100-1000μl
2）多道移液器，50-200μl
3）洗板机及洗涤瓶
4）37℃温育器
5）带450nm滤光片的酶标仪
4.2试剂盒的储存与稳定性
试剂盒应当2-8℃的环境下运输。包被板条一但被拆开，应当将其重新密封好。拆开了板条储存于2-8℃的环境下时，其免疫活性可稳定6周。
4.3试剂的准备
实验开始前将所需数目的板条和所有试剂都平衡到室温。试剂盒可分3次进行检测，下面所述体积可用来检测4条包被板条（32个检测孔）。如果实验中需使用更多板条，则体积应当相应的进行改变。
4.3.1洗涤液，在30ml浓缩的洗涤液中加入600ml双蒸水。
4.3.2稀释液，在每支冻干的稀释液中加入20ml即用型的洗涤液。
4.3.3标准品、质控血清
a）S5（500mU/100μl），将每支标准品用1ml即用型的洗涤液进行稀释。重新配制好的标准品（标准品S5）100μl内含500mU抗精子抗体。
b）其它浓度的样品可用稀释液进行连续稀释获得，具体如下：
S5 500mU/100μl
S4 250mU/100μl= 500μl S5 + 500μl稀释液
S3 125mU/100μl= 500μl S4 + 500μl稀释液
S3 62.5mU/100μl= 500μl S3 + 500μl稀释液
S2 31.3mU/100μl= 500μl S2 + 500μl稀释液
S0 0 mU/100μl= 500μl稀释液（零标准品）
c）质控血清，在每支冻干的质控血清中加入1ml即用型的洗涤液。
4.3.4酶联物，在15μl浓缩的酶联物中加入9ml稀释液，混合均匀。
4.4准备好试剂的储存与稳定性
4.4.1配置好的洗涤液在2-8℃的环境下可稳定存放4周。冷藏时溶液会出现磷酸盐沉淀物，室温下又会溶解。
4.4.2样品稀释液，配置好的稀释液在2-8℃的环境下可稳定存放2天，如果冻存于-20℃的环境下则可存放更长时间。
4.4.3标准品、质控品，应在每次实验时临时配置，并且仅能使用一次。
4.4.4酶联物，配置好的酶联物可在室温下稳定存放20min。
4.5试剂盒的处理
按照国家*条理处理试剂盒，具体信息请见产品的材料安全数据单。
4.6破损试剂盒的处理
如果试剂盒有破坏的请与IBL公司或是提交您的投诉单，但自您拿到试剂盒后zui迟不超过一个星期。严重破损的成分不能用于实验，将其保存好直至找到zui终的解决办法。之后，按照*条例将其处理掉。
5、样品
5.1采集
血清：按照一般原则进行静脉采血。不要使用明显溶血、黄疸血和脂血样品。
精液：精液样品应当用1000的转速离心15分钟，之后用上清做实验（精液）。
5.2储存
血清、精液：采集的样品存放于2-8℃的环境下时，必须在24小时内将其检测掉。如果想将血清存放更长时间，可以将血清冻存于-20℃的环境下，避免反复冻融。
5.3预处理
血清、精液：用稀释液将病人样品按1：51的比例进行稀释（例如：10μl样品+500μl稀释液），混合均匀。
6、实验步骤
一般注意事项：实验开始前，应当将所有的试剂和样品都平衡到室温。所有试剂混合时都应避免泡沫产生。为了避免交叉反应，每份试剂、标准品和样品都应使用新的取样吸头。在实验开始前，我们建议您将所有的试剂都准备好，将盖子移去，将所需数目的板条置于板架上等。这些准备工作可保证每一加样步骤间的时间间隔相同并且无中断。将所需数量的板条固定到板架上准备加样。
6.1实验步骤
6.1.1加100μl标准品、质控品和样本于相应反应孔中
6.1.2封板后37℃温育60分钟。
6.1.3每孔用300μl洗涤液洗板3次（建议您使用洗板机），吸水纸上拍干。注意：洗板步骤是否操作正确会明显影响实验的灵敏度和精密度。
6.1.4在每一微孔中加入100μl酶联物。
6.1.5封板后37℃温育60分钟。
6.1.6每孔用300μl洗涤液洗板3次
6.1.7在每一微孔加TMB底物液100μl。
6.1.8室温（18℃-24℃）温育10-15分钟。
6.1.9每孔加50μl终止液以终止底物反应，轻轻振板以使溶液混合均匀。
6.1.10加终止液后30min内在450nm读取OD值。（参考波长：600-650nm）
6.2结果计算
标准品、质控品和病人样本结果的计算：
在双对数坐标纸上，以标准品的OD值对标准品浓度作一条标准曲线。用标准曲线计算未知样品（已稀释）总的抗精子抗体浓度（mIU/100μl）。zui后将结果乘以0.5便得到未稀释样品的浓度（U/ml）。
U/ml=Mu/100μl ×
= mU/100μl×0.5
50（稀释因子）×10（100μl转换成1ml的转换系数）
1000（mU变成U的转换系数）
自动计算：
用三次回归、四参数或双对数方程做标准曲线图一般都可以获得较好的效果。至于结果的准确度请件第7项（实验特性）。样品中抗体浓度高于zui高标准品的应当用相应的稀释液稀释并重新检测。zui后将结果乘以相应的稀释因子即可。
下面是抗精子抗体ELISA试剂盒标准曲线的一个典型范例：
样品 OD值
浓度（mU/100μl）
S0 0.057 0.00
S1
S2
S3 0.264 31.3
0.484 62.5
0.886 125
S4 1.353 250
S5 2.170 500
6.3自动检测
IBL公司的实验室以证明：抗精子抗体ELISA试剂盒可用全自动酶免分析仪来做。操作说明可直接向IBL索取或从IBL公司的主页上下载。具体信息请将“自动检测”项。
7、实验特性
7.1期望值
建议每个实验室都确定自己实验室的正常值范围。在正常范围的研究中，所有参与研究的人群都是明显健康的个体，正常值的范围的个体应当在95%上。
正常范围（血清、精液）：＜150mU/100μl，相应的在未稀释样品中范围为：＜75U/ml。
7.2特异性
包被板的微孔中包被了纯化的精子特异性抗原。目前没有发现它与其它抗体间有交叉反应。
7.3灵敏度
此试剂盒可检测到的zui低浓度为0.14mU/100μl（等于零标准品OD值的平均值减去两倍的标准差），在未稀释的样品中对应为0.07U/ml。
7.4精密度
7.4.1板内差异
在实验中，用五中不同的质控血清做双份检测来确定板内差异。板内差异实验结果如下：
样品 数量 平均值（mU/100μl） 标准差（mU/100μl） CV（%）
1 15 47.0 2.0 4.3
2 15 64.0 7.6 11.9
3 15 98.0 2.6 2.7
4 15 59.0 4.5 7.6
5 15 151.0 11.8 7.8
7.4.2板间差异
在实验中，用五中不同的质控血清做双份检测来确定板间差异。板间差异实验结果如下：
样品 数量 平均值（mU/100μl） 标准差（mU/100μl） CV（%）
1 15 42.0 3.3 7.9
2 15 48.0 7.4 15.4
3 15 77.0 7.7 10.1
4 15 74.0 7.2 9.7
5 15 130.0 17.6 13.6
7.5准确性
7.5.1线形度
用稀释液稀释血清样品以得到八份精子抗体浓度不同的血清样品，再用ELISA试剂盒检测已释样品中精子抗体的浓度。对三份样品都进行了稀释,结果如下:
样品 P1（mU/100μl） 重现性（%） P2（mU/100μl） 重现性（%） P3（mU/100μl） 重现性（%）
1:1 205.1 100 241.5 100 259.4 100
1:2 100 98 132.8 110 138.6 107
1:4 50.8 99 64.0 106 68.0 105
1:8 32.7 128 32.0 106 35.4 109
样品 P4（mU/100l） 重现性（%） P5（mU/100μl） 重现性（%） P6（mU/100μl） 重现性（%）
1:1 272.8 100 242.2 100 366.5 100
1:2 141.4 104 116.0 96 163.3 89
1:4 61.9 91 57.7 95 64.9 71
1:8 31.4 92 33.2 110 33.8 74
样品 P7（mU/100μl） 重现性（%） P8（mU/100μl） 重现性（%）
1:1 376.9 100 331.0 100
1:2 171.9 91 139.4 84
1:4 83.0 88 82.1 99
1:8 49.0 104 42.9 104
7.5.2重现性
用已知浓度的样品浓缩四份血清样品以提高精子抗体的浓度（所有结果单位都为mU/100μl）.
样品 内源性抗体浓度（mU/100μl） 加入样品的浓度（mU/100μl） 期望值（mU/100μl） 测的值（mU/100μl） 重现性（%）
1 52.0 346.0 398.0 307.0 77
52.0 169.0 221.0 175.0 79
52.0 68.0 120.0 116.0 97
52.0 35.0 87.0 80.0 92
52.0 16.0 68.0 69.0 101
2 76.0 346.0 422.0 329.0 78
76.0 169.0 245.0 236.0 96
76.0 68.0 144.0 140.0 97
76.0 35.0 111.0 108.0 97
76.0 16.0 92.0 91.0 99
3 79.0 326.0 405.0 354.0 87
79.0 163.0 242.0 198.0 82
79.0 72.5 151.5 136.0 90
79.0 34.5 113.5 112.0 99
79.0 17.5 96.5 89.0 92
4 120.0 319.0 439.0 356.0 81
120.0 159.5 279.5 231.0 83
120.0 69.5 189.5 180.0 95
120.0 34.0 154.0 149.0 97
120.0 18.0 138.0 130.0 94
7.5.3方法比较
IBL抗精子抗体ELISA试剂盒与ELIAS抗精子抗体ELISA试剂盒进行比较
IBL抗精子抗体ELISA试剂盒与市场上可买到的抗精子抗体ELISA试剂盒同时检测38份病人样品.线形回归结果统计如下:
IBL ELISA=4.0698×ELIAS ELISA+1.0441;相关系数=0.869;数量=38
7.5.4质量控制
根据国家规定，我们建议您用质控品。使用质控品可以保证结果的逐日有效性，正常的和病理水平的质控都必须使用。质控实验室的质控品及相应的结果记述在试剂盒的IBL的质控单上。质控单上的数据及范围通常都与相应的批次对应，而且可直接用于结果比较。为了保证结果的准确性，建议使用国家或质量评估程序。采用合适的统计方法分析质控值。如果检测结果不在质控材料已确定的可接受范围内，则病人的结果视为无效。在这种情况下，请检查下列技术区：加样及记时设备；酶标仪；试剂有效期；储存及温育条件；抽吸及洗板方式。如果检查了上述设备并且没有发现任何问题，请直接IBL公司的代理商。
8、实验的局限性
8.1干扰物质
样品处理不当或改变实验程序都可能影响实验结果。样品处理不当对实验所产生的影响请见“样品采集”。叠氮钠和硫柳汞浓度高于0.1%都会影响此实验。因此，上述成分在质控血清或样品中浓度高于所述浓度时都可能会导致错误的实验结果。
8.2高剂量钩状效应
在抗精子抗体ELISA试剂盒中没有发现高剂量钩状效应。
9、法律方面
9.1结果的可靠性
实验必须严格按照生产产家的说明书进行操作。另外，实验者必须严格遵守实验室优化管理规则或其它可应用的国家标准或法律。这与质控试剂的使用有很大的相关性。为了确保实验的准确度和性，每个实验都必须包含有足够数量的质控品。如果所有的质控品都在特定的范围内，其他所有检测参数也在所给的检测范围呢，实验结果才有效。如有任何疑问请IBL公司。
9.2投诉
至于在投诉单（使用产家的投诉单）以书面形式上交时才才能受理，而且投诉单内必须包含试剂盒的所有信息及实验结果。投诉单的格式可以向IBL索取。
9.3治疗方法
即使所有实验结果都与9.1项所述要求相吻合，治疗方法也不能根据实验结果做出论断。任何实验结果都只是病人临床症状的一部分。只有当实验结果与病人所有的临床症状一致时，我们才可以根据实验结果确定治疗方法。实验结果本身就从来不能作为确定治疗方法的*因素。
9.4责任性
对试剂盒做任何修改、交换或混合不同批次的试剂盒成分都会对预期结果和所有实验结果的有效性产生负面影响。对试剂盒做了这种修改和交换都不能要求供货商再包换。如果客户理解错误实验结果而投诉，则视为无效。不管是任何形式的投宿，生产商所负的责任都不会超过试剂盒本身的价格。试剂盒在运输过程中所造成的破坏生产商都不负责任。
