利用布鲁克的定量软件包， 进行自由基和过渡金属的鉴定和定量

EPR

利用布鲁克的定量软件包，

进行自由基和过渡金属的鉴定和定量

秉持诚信 不断创新

摘要

在科学研究和过程/质量控制中利用分析技术鉴定和定量特定物种，是一项挑战。电子顺磁共振（EPR）波谱就是这样一项 技术，它适用于鉴定和定量液体或固体样品中的自由基和过渡金属离子。凭借获由SpinCount和SpinFit模块组成 的定量软件包，布鲁克让EPR技术变得更易用、更便捷。该定量软件包对于所有采用Xenon和Xepr软件的布鲁克EPR波谱仪 是标配，对于采用ESRStudio软件的Magnettech ESR5000波谱仪是可选项。该定量软件包可直接实现样品的精准定量，而 无需与标准样品或单独测得的校准曲线进行比较。由此布鲁克可为众多不同的科学研究或过程/质量控制提供一种可靠易 用的解决方案。

引言

利用波谱技术对样品中的特定物种进行定性或定量，是进行科学研究和过程/质量控制的基础。电子顺磁共振（EPR）波谱 让研究人员能够鉴定和定量样品中的自由基和过渡金属离子。和大多数光谱技术不同的是，EPR对样品不透明度或浊度没 有限制，且定量信息不依赖于消光系数的精度。通过EPR鉴定顺磁性物质只取决于物种本身的性质。与核磁共振（NMR）波 谱等其他磁共振技术不同的是，EPR不受分子量的限制。只需对来自目标自由基或过渡金属离子的EPR信号进行二重积分，  即可获得定量信息，可以免于来自非顺磁性物质的干扰。然而，即使是用EPR来鉴定物种也依赖于知识储备，且定量时通常 需要花费大量时间去构建标准曲线。

为了解决所有光谱技术存在的共同局限及EPR存在的挑战，布鲁克打造出了荣获SpinFit和SpinCount软件包。该软 件包能够无需参比物直接定量和明确鉴定不同样品中的顺磁性物质。SpinCount让研究人员能够从原始数据中获取定量信 息，而无需与标准样品进行比较，亦无需用到校准曲线。SpinFit模块及其中所含的常见自由基和过渡金属离子的谱图库， 让研究人员即使只具备很少的知识储备也能鉴定出物种。取决于所用软件，EPR波谱仪最多可配置来自SpinFit家族的三个 成员： Isotropic SpinFit、SpinFit Liquids和Aniso SpinFit。SpinFit通过将原始数据与一个小参数集进行拟合来轻松实现物 种鉴定，而用户只需输入很少的信息。Isotropic SpinFit和SpinFit Liquids是用于模拟和拟合溶液中的自由基和过渡金属的 CW-EPR谱图的程序。Isotropic SpinFit用于模拟和拟合非粘性溶液的各向同性谱图。SpinFit Liquids对这一功能进行了扩 展，增加了测定溶液中自由基翻滚速度（旋转相关时间）的功能。模拟不同运动状态下的谱图，需要在能自动确定运动状态 的SpinFit Liquids中实现的不同理论描述。Anisotropic SpinFit用于模拟冷冻溶液和粉末的谱图。

SpinCount无需参比物即可实现定量

. 高精度，无需参比物，通过二重积分直接利用原始数据计算出浓度

. 在SpinCount的计算中涵盖了仪器参数的影响

. 集成于波谱仪的控制软件，使得研究人员可在完成数据采集后立即轻松快速地实现自由基定量

图1所示为，利用SpinCount进行290 K温度下的硫酸氧钒（VOSO4）水溶液的定量。用户只需在SpinCount中利用区域限定工具 选择二重积分区域，该区域的二重积分然后被换算成样品中的总自旋数、自旋摩尔浓度及单位体积自旋数(spins/mm3)。

图1：实验谱图显示为红色。 通过对实验谱图进行二重积 分（蓝色），SpinCount确定    出自旋数、摩尔浓度和自旋   数/mm3，如绝对自旋数报告 中所示。

一个重要的注意事项是不同的样品条件。例如，观测到的EPR谱图会随温度的变化而变化，这会导致在不同温度下研究的相同 样品所获得的二重积分不同。正如图2所示，其中显示了来自图1的VOSO4样品在150 K温度下处于冷冻状态时所观测到的谱 图。SpinCount在计算中考虑到了样品温度，因此可以提供一致的定量信息，而不受二重积分的变化影响。这也适用于未发生 相应温度变化时的物理状态改变，因为从液态到固态的相变会以类似的方式导致谱图改变。

图2：在150 K温度下研究来 自图1的、处于冷冻状态的相 同VOSO4样品。SpinCount采 用相同的二重积分方法从实 验谱图中计算出自旋数、摩 尔浓度及自旋数/mm3。

利用SpinFit模块轻松快速地鉴定自由基

. 用于处理固态（Aniso SpinFit）和液态（SpinFit Isotropic和SpinFit Liquids）样品中的自由基和过渡金属物种

. 拥有鉴定时常见物种的谱图库

. 能够鉴定和解析多个物种

. 与SpinCount轻松对接

. 自动选择动态机制（SpinFit Liquids）

. 集成于波谱仪的控制软件，使得研究人员可在完成数据采集后立即轻松快速地完成顺磁性物质鉴定

顺磁性物质的未成对电子会与它们的局部环境相互作用，从而产生可用于鉴定该物质的特征EPR谱图。SpinFit通过将原始数 据与一个小参数集进行拟合来轻松实现物种鉴定，而用户只需输入很少的信息。当顺磁性物种未知时，SpinFit拥有一个全面 的常见自由基和过渡金属谱图库，并带有相应的拟合参数，可帮助实现轻松快速的物种鉴定。由于处于液体和固体状态的样品 都能进行研究，SpinFit提供了不同的参数选择来满足每种样品状态所需考虑的不同参数。图3所示为，利用SpinFit Isotropic来 拟合在290 K下研究的VOSO4样品的谱图。用户只需输入或上传一组起始参数，SpinFit Isotropic即可自动找到精准地拟合该 谱图所需的正确参数集。

图3：处于液体状态的VOSO4 样品的实验谱图（蓝色），显   示出由8条谱线组成的特征   裂分谱线⃞源自未成对电  子与MI  = 7/2钒核之间的超  精细耦合。拟合谱图所用的   参数显示在Spin Fitting窗口中，获得的拟合谱图显示 为红色。

与此同时，Aniso SpinFit能够满足拟合固态样品的谱图所需的额外参数。图4所示为，利用Aniso SpinFit来鉴定来自图2的、处 于冷冻状态的VOSO4样品。和液态样品一样，用户可以输入或者直接从谱图库上传所有参数。

图4：在150 K温度下研究来自图1和图3的VOSO4样  品时，获得了与固态样品一致的谱图。进行拟合时，Aniso SpinFit考虑了全   面描述固态样品的谱图所需 的额外参数。

SpinCount与SpinFit模块联用

. 即使信噪比低，也能实现高精度定量

. 解析多个重叠谱图，以测定它们各自的浓度

. 借助SpinFit模块也可获得原始数据中包含的相同定量信息

前面的例子证明，SpinCount能够将EPR谱图转换成样品中的自旋数，SpinFit模块能够拟合EPR谱图。研究人员面临的一个常 见问题是，从含有多种顺磁性物质的样品中获取定量信息时，会受到谱图重叠的干扰。在这种情况下，无法利用谱图的二重积 分来获得单个物种的定量信息。通过将SpinFit与SpinCount的功能相结合，即可获得含多种物质的样品的定量信息。SpinFit 将实验谱图与包含多种物质的模型谱图进行拟合，并分离出单个谱图。然后，SpinCount通过计算而非二重积分来获得定量 信息。例如，图5中的谱图即源自于由三张谱图组成的重叠谱图，每张谱图对应于聚山梨酯的三种不同氧化产物之一。通过 SpinFit Isotropic鉴定出三种聚山梨酯自由基后，再通过SpinCount分别进行每种自由基的定量。如此，即使是含有多种物质的 样品，SpinFit Isotropic也能轻松实现样品中单个物种的鉴定和定量。

图5：实验谱图（黑色）是从聚山梨酯自由基混合物中收 集到的原始数据。模拟谱图   （蓝色虚线）是分别显示为黄色（烷基）、绿色（烷氧

基）和橙色（过氧基）的三张谱图的总和。模拟谱图是根据 各自所显示的浓度对三份单张谱图进行加权求和所得。SpinFit Isotropic同时计   算出每张谱图及三张谱图之  和，使得每个物种可被单独   地分离出并进行分析。因此， 尽管谱图重叠，SpinCount也 可利用该信息给出每个物种  的浓度。

图6和图7所示为，如何利用Aniso SpinFit 进行混合物样品的鉴定和定量。本例中的谱图源自于处于不同配位环境下的过渡金 属配合物。通过对照Anisotropic SpinFit的谱图库，在谱图中鉴定出低自旋和高自旋Fe(III)信号。Aniso SpinFit再自动找到精准 地拟合总谱图所需的每个物种的正确参数。

围6：实验谱图（蓝色）源自于由处于不同配位环境下的 三种血红素配合物组成的混合物样品。该数据改编自   （Ruetz, M.等人，远端配体   抑制硫化氢与人神经球蛋白 的相互作用，J. Biol. Chem., (2017) 292, 6512-6528）。通  过对照Aniso SpinFit的谱图  库，实验谱图被拟合（红色） 成由三张不同Fe(III)谱图叠   加而成的总谱图，这三张谱   图分别对应于一种高自旋配 合物和两种低自旋配合物。 单张谱图显示在图7中。

图7中的谱图是Aniso  SpinFit从图6的实验谱图中鉴定出的单张谱图。Aniso SpinFit根据每张谱图对总谱图的相对贡献计算出 每个物种的浓度。

围7：Aniso SpinFit鉴定出三 个Fe(III)物种，SpinCount再  对每个物种进行定量。从绝  对自旋数报告中可以得出， 样品中的高自旋Fe(III)物种   （红色谱图）浓度为2.3 μM， 低自旋Fe(III)物种（蓝色谱图）浓度为47 μM，另一个低 自旋Fe(III)物种（橙色谱图） 浓度为12 μM。

除了重叠谱图，研究人员还经常面临自由基浓度低导致数据的信噪比低的挑战。浓度低可能是由样本量受限或所研究反应的 收率低所造成的内在限制。虽然可以使用信号平均法，但这会非常耗时，或者可能受到快速反应动力学的限制。在这种情况 下，SpinFit与SpinCount联用同样可以发挥良好的作用。高噪声的实验谱图被拟合成无噪声的模拟谱图，再通过模拟谱图计算 出浓度。图8中所示的条形图，对比了重复测量自由基浓度为1 μM的样品所得到的结果。通过二重积分确定浓度时，SpinCount 所得出的结果精度很低。如果先用SpinFit拟合高噪声谱图，再直接计算出浓度，则精度可大幅提高。

图8：SpinCount通过对低浓  度样品的EPR谱图进行二重 积分（橙色）来获得定量结果 时，所得到的RSD为21%。如果先拟合高噪声谱图，再 直接计算出浓度（蓝色），则 精度可以提高，而所得到的 RSD为3%。

SpinCount和SpinFit让二维数据分析变得更简单

. 研究外部刺激因素对EPR谱图的影响，从而构建二维数据集

. 考虑到外部刺激因素的物种鉴定和定量

布鲁克EPR波谱仪拥有丰富的附件，可用于进行众多不同类型的EPR研究。通常需要监测样品温度或原位紫外辐照等常见外  部刺激因素对EPR谱图的影响。获得EPR谱图在外部刺激因素的影响下随时间的变化趋势，可供深入了解反应机制和动力学。 为了能以这样的灵活性开展实验，布鲁克EPR波谱仪提供了一些可选的一维和二维实验类型。但对于多维EPR数据，分析过程  可能非常耗时。为了解决这个问题，布鲁克设计出了能够逐层分析二维数据集的SpinCount和SpinFit软件包。

图9所示为，如何通过Isotropic SpinFit与SpinCount联用，来测定混合物样品（如图5中的聚山梨酯）中浓度随时间发生的变化。 虽然图5中的单张谱图能够反映聚山梨酯发生氧化反应的过程，但随着时间的推移和反应的进行，每个物种的浓度也在上升  或下降。演变谱图能够反映每个物种的浓度随反应时间的推移而发生的变化。SpinCount的结果显示，可以同时计算每个物种  的浓度。即，通过SpinFit和SpinCount的联用，我们可以深入了解每个物种的反应机制或动力学，即使样品中含有多种物质。

图9：通过采集随反应时间  而变化的EPR谱图，来观测  EPR 谱图在聚山梨酯氧化  反应过程中的演变趋势 。 浓度与时间的关系图表明  了，SpinCount如何在SpinFit  的帮助下，同时追踪图5中所  示的每个物种浓度，即使它  们的谱图重叠。

图10给出了一个利用SpinCount进行硝苯地平自由基定量的例子。在本例中，硝苯地平自由基是通过紫外光照射1.5小时所产 生。从谱图中的信号振幅不断变大可以看出，自由基浓度随照射时间的延长而增加。SpinCount通过逐一计算每个时间点的二 重积分，来体现自由基浓度随时间的变化。

图10：硝苯地平自由基是通 过紫外光照射所产生。该图 所示为，谱图振幅随照射时 间的延长而不断变大。绝对 自旋数报告表明，SpinCount 如何通过测定每个时间段的 浓度，来体现自由基浓度随 紫外光照射时间的变化。

利用SpinFit Liquids进行分子运动分析

. 自动测定运动状态

. 计算旋转相关时间

CW EPR信号可以分为不同的运动状态。（1）各向同性极限状态：非粘性溶液中的快速运动分子；（2）中间状态：分为快速和慢 速运动状态，粘性溶液中的样品或分子量较大以致于限制分子运动的分子；（3）刚性极限状态：粉末、玻璃和冷冻溶液等固体 样品。SpinFit Liquids模拟模块适用于拟合所有液体样品（包括中间状态和各向同性极限状态）的谱图。模拟包含多个组分的 EPR谱图，有助于研究复杂生物系统的动态。图11所示为，与组氨酸激酶家族的一种蛋白质结合的ADP自旋标记类似物（ADP- NO）的EPR谱图。从图中可以看出，该谱图是由两个组分叠加而成：三条窄线代表溶液中的游离ADP-NO，而较宽部分代表与

蛋白结合的ADP-NO所产生的信号。分子运动速度通过旋转相关时间τ（单位：ns）来描述。旋转相关时间越短，分子运动速度

c

越大。SpinFit Liquids允许同时进行多个组分的模拟，从而获得两个组分的分子动态参数及它们的相对分数。这些研究可为了 解ATP依赖蛋白及生物聚合物的功能提供重要见解。