T4 DNA连接酶可以催化粘端或平端双链DNA或RNA中毗邻的5’磷酸基团和3’ 羟基末端之间形成磷酸二酯键。酶还可以修复双链DNA，RNA或DNA/RNA复合体中的单链切口，连接DNA的粘性和平末端，但是该酶对单链核酸无酶活性。
T4 DNA连接酶的作用过程可以分为3个步骤：
1、连接酶的赖氨酸活性位点对ATP的α-磷酸基团亲核攻击，释放PPi，并生成T4 DNA连接酶-AMP中间体。
2、DNA链的5' -磷酸基团攻击连接酶-AMP中间体，AMP被转移到DNA链的5' -磷酸基团上，生成DNA-腺苷酸中间体。
3、DNA链的3' -羟基进攻5' -磷酸基团，形成磷酸二酯键，释放AMP。
使用注意事项：
1、使用前应在室温放置至融化或用手掌温度辅助融化，然后置于冰上。不要加热融化以免ATP降解。
2、T4 DNA Ligase对热敏感，容易失活。使用时请放置冰上，用后立即置冰箱中冷冻保存。
3、如需在接反应后灭活T4 DNA Ligase，可于65℃孵育10min即可。
