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使用 ProteOrange 进行蛋白质凝胶染色

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2024/3/14 12:07:05

ProteOrange 染料可以在聚丙烯酰胺凝胶中电泳后快速、轻松地可视化蛋白质。 ProteOrange 是一种二苯乙烯型荧光团,含有两性离子片段。在核酸、多糖和其他分子存在的情况下,蛋白质/十二烷基硫酸钠胶束 (SDS) 选择性地结合染料。 ProteOrange 可有效对分子量为 6 kDa 及以上的蛋白质进行染色。在三个数量级覆盖的浓度范围内,荧光信号与蛋白质浓度呈线性关系。

ProteOrange 凝胶染色的灵敏度大约是考马斯染色的十倍,但不如银染色敏感。对于 ProteOrange,检测限为每条带 3 ng 蛋白质(考马斯的检测限约为 30 ng,银染的检测限约为 0.5 ng)。然而,与银染相比,ProteOrange 染色的方案要简单得多,因为它不需要洗涤,也不需要标准 SDS-PAGE 的固定。实验流程需要 30-60 分钟才能完成,包括在含有染料的 7.5% 乙酸水溶液中孵育凝胶,以及用 7.5% 乙酸短暂冲洗凝胶 30 秒。应使用波长为 312-365 nm 的透射仪进行可视化。 ProteOrange 库存溶液在室温下避光保存。

协议

  1. 确保染料原液不含沉淀物。如果不是这种情况,请将试剂在 70 °C 下保持几分钟,直至沉淀物全溶解,然后摇动小瓶。

  2. 准备染料的工作溶液。准备的量取决于凝胶块的大小和托盘尺寸。例如,25 mL 的溶液足以制备 10 × 15 cm 的凝胶片。要制备此溶液,请将 1.88 mL 冰醋酸溶解在 23 mL 水中,制成 7.5% 乙酸,并添加 5 μl 5000x ProteOrange 溶液。搅拌均匀,避光保存不超过三小时。

  3. 电泳结束后,将凝胶放入托盘中,加入染料工作液,避光孵育20-60分钟(对于较薄的凝胶或较低百分比的凝胶,应缩短时间;对于1 mm的凝胶,60分钟最佳厚,15% 凝胶)。染料的工作溶液只能使用一次,因为重复使用会导致灵敏度降低。

  4. 用 7.5% 乙酸溶液(不含染料)冲洗凝胶 30 秒。凝胶已准备好进行可视化。

  5. 为了可视化,将凝胶放在透照仪上。

  6. 要去除染料,请将凝胶在 0.1% Tween 20 溶液中孵育 10-12 小时,或用 7.5% 乙酸溶液反复清洗。

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