l保存期：6个月
l保存条件：2-8℃
[实验原理]
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠（Acetyl-Foxo3a）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。
[样本处理及要求]
1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2. 血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。
4. 细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
[需要而未提供的试剂和器材]
1.酶标仪（450nm）
2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.37℃恒温箱
4.蒸馏水或去离子水
备注：
1. 标准品浓度依次为：600、300、150、75、37.5、18.75 ng/mL
2. 经过大量正常标本检验，标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内，实验过程中直接取50μL样本上样即可。当有部分样本值超过大标准品浓度时，可用将标本进行适当稀释后再进行实验。
[注意事项]
1.严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。
2.洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。
3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。
4.底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。
5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
6.在储存和温育时避免强光直接照射。
7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。
8.任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。
9.不能使用过期产品。
10.如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。
[试剂准备]
从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。
20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。
[操作步骤]
1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3. 样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
[实验结果计算]
以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。
[试剂盒性能]
1. 检测范围：18.75 ng/mL – 600 ng/mL。
2. 灵敏度：低检测浓度小于1.0 ng/mL。
3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。
[说明]
1.由于现有条件及科学技术水平尚不能对所有供货商提供的所有原料进行全面的鉴定与分析，本产品可能存在一定的质量技术风险。
2.终的实验结果与试剂的性、实验者的相关操作以及当时的实验环境密切相关，请务必准备充足的标本备份。
3.不同批次的同一产品可能会有少许差别，如：检测限、灵敏度以及显色时间等，请依据试剂盒内说明书进行实验操作，网站电子版说明书作参考。
4.只有全部使用本试剂盒配套试剂才能保证检测效果，不能混用其他制造商的产品。只有严格遵守本试剂盒的实验说明才会得到佳的检测结果。
5.本公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本的可能使用量，预留充足的样本。
6.使用化学裂解液制备的组织匀浆或细胞提取液可能会由于某些化学物质的引入导致ELISA实验结果偏差。
7.若样本为细胞培养上清，因该类样本干扰因素较多，如：细胞状态、细胞数量、采样时间等，所以可能存在检测不出的情况。
8.某些天然蛋白或重组蛋白，包括原核及真核重组蛋白，可能因为与本产品所使用的检测抗体及捕获抗体不匹配，而不被检测出。
ELISA检测试剂盒承诺
公司长期与各大科研单位保持着良好的合作关系，公司的产品质量及服务态度得到了他们的一致认可。笃玛生物本着客户至上的原则为客户提供优质产品，公司承诺产品有任何质量的问题免费包退换（非人为因素造成的）。公司提供免费代测服务，并且承诺收到样本七个工作日出结果，确保数据的准确性。
试验原理：
本试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系。
完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：
（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；
（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；
（3）酶的底物；
（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；
（5）结合物及标本的稀释液；
（6）洗涤液，在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水；
（7）酶反应终止液，常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的*终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。
自备材料
1）蒸馏水。
2）加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3）振荡器及磁力搅拌器等。
试剂盒安全性
1）避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
2）实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
3）不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
操作注意事项
1）试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
2）实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
3）不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
4）使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
5）使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
6）洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
7）底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。
8）加入试剂的顺序应一致，以所有反应板孔温育的时间一样。
9）按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
试剂盒样品收集、处理及保存方法
1）血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2）血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。
3）细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4）组织匀浆-----将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液
5）保存------如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70 ℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
试剂盒试剂的准备
1）标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。
2）洗涤缓冲液（50×）的稀释：蒸馏水50倍稀释。
试剂盒操作步骤
1）使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
2）根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。
3）加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。
4）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
5）每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
6）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
7）每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。
8）取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
9）在450nm波长处测定各孔的OD值。
试剂盒局限
6号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。
试剂盒试剂盒性能
1. 灵敏度：小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。
2. 特异性：不与其它细胞因子反应。
3. 重复性：板内、板间变异系数均小于10%。
试剂盒结果判断与分析
1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值
2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的待测物质标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的待测物质含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。
ELISA检测试剂盒承诺
公司长期与各大高校、医院及科研单位保持着良好的合作关系，公司的产品质量及服务态度得到了他们的一致认可。笃玛生物本着客户至上的原则为客户提供优质产品，公司承诺产品有任何质量的问题免费包退换（非人为因素造成的）。公司提供免费代测服务，并且承诺收到样本七个工作日出结果，确保数据的准确性。
