皖仪科技液相色谱对原料乳和乳制品中三聚氰胺的检测
前言
“三聚氰胺”，一个原本拗口生僻的化学品名字，如今再提及时，仍会令国人谈之色变。15年前，对中国乳业来说，“三聚氰胺”在如此大面积的“舞台”上的无耻跳踉，几乎是一次空前的灾难。而对中国消费者来说，带给我们最大的震撼是，一个高速发展、体量庞大的中国乳品工业，其安全基础竟如此脆弱。此事件后，为进一步加强对原料乳、乳制品以及含乳制品的监管要求，国家质检总局出台了一系列国家标准法规文件，明确了三聚氰胺含量检测为原料乳与乳制品检测中的必检项目。
本篇文章参考了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》GB/T 22388-2008高效液相色谱法条件，采用皖仪科技高效液相色谱仪LC3200系列配置紫外检测器进行检测。实验结果表明，三聚氰胺的线性良好，R值在0.999以上，三聚氰胺标准品色谱峰正常，理论塔板数在15000以上。三聚氰胺标准品重复进样6次，定性RSD值为0.165%，定量RSD值为0.356%，重复性较好。仪器检测限为0.0096μg/mL，定量限为0.032μg/mL。在回收率实验中，液态奶中三聚氰胺加标浓度分别为0.8μg/mL、2μg/mL、4μg/mL，测定5次进行分析，相对标准偏差分别为1.09%、0.76%、0.88%，加标回收率分别为83.3%，88.8%，94.5%。说明了该方法配备皖仪科技LC3200系列仪器满足三聚氰胺的检测需求。
1 实验方法
1.1 仪器配置
表1 高效液相色谱系统配置清单
1.2 实验材料及辅助设备
甲醇：色谱纯；
乙腈：色谱纯；
氨水：含量 25%～28%；
三氯乙酸；
柠檬酸；
辛烷磺酸钠：色谱纯；
三聚氰胺标准品：CAS 108-78-01，纯度大于99.0%；
定性滤纸；
微孔滤膜：0.22μm；
pH计；
超声波清洗机；
固相萃取装置；
氮气吹干仪；
涡旋混合器。
1.3 测试条件
流动相：离子对试剂缓冲液：乙腈=88:12；
色谱柱：C18色谱柱，4.6×150mm；
柱温：40℃；
流速：1.0 mL/min；
进样量：20μL；
检测波长：240nm。
1.4 溶液配制
1.4.1 甲醇水溶液
准确量取50mL甲醇和50mL水，混匀后备用。
1.4.2 三氯乙酸溶液（1%）
准确称取10g 三氯乙酸于1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。
1.4.3 氨化甲醇溶液（5%）
准确量取5mL氨水和95mL甲醇，混匀后备用。
1.4.4 离子对试剂缓冲液
准确称取2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠，加入约980mL水溶解，使用氨水调节pH至3.0后，定容至1L备用。
1.4.5 三聚氰胺标准储备液
准确称取100mg（精确到0.1mg）三聚氰胺标准品于100mL容量瓶中，用甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/mL的标准储备液，于4℃避光保存。
1.4.6 三聚氰胺工作溶液
用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为0.8μg/mL、2μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL的标准工作液，浓度由低到高进样检测。
2 结果与讨论
2.1 系统适用性
图1 流动相色谱图
图2 三聚氰胺标准品色谱图
表2 三聚氰胺标准品色谱参数
说明：由上述谱图可见，三聚氰胺标准品色谱峰正常，保留时间为15.498 min，理论塔板数为15000以上。
2.2 标准曲线
图3 三聚氰胺标准曲线及相关系数
说明：本次测试的三聚氰胺标准工作曲线浓度为0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL。三聚氰胺标准曲线线性范围较好，线性相关系数R＞0.999，满足实验分析需求。
2.3 重复性
图4 三聚氰胺标准品重复性实验色谱图
表3 三聚氰胺标准品色谱参数
说明：三聚氰胺标准品重复进样6次，保留时间RSD值为0.165%，峰面积RSD值为0.356%，重复性较好。
2.4 检出限
图5 三聚氰胺标准品色谱图
表4 三聚氰胺标准品色谱参数
说明：结果表明使用配备皖仪科技LC3200系列仪器检测三聚氰胺标准品的检测限为
0.0096μg/mL，定量限为0.032μg/mL。
2.5 加标回收验证
2.5.1 提取
选择液态奶作为基质，称取2.03g试样于50mL具塞塑料离心管中，加入15mL三氯乙酸溶液（1%）和5mL乙腈，超声提取10min，在振荡提取10min后，以不低于4000r/min离心10min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL 滤液，加入5mL水混匀后做待净化液。
2.5.2 净化
将待净化液转移至阳离子交换固相萃取柱（基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，体积3mL,填料质量60mg）中。依次用3mL 水和3mL甲醇洗涤，抽至近干后，用6mL氨化甲醇溶液（5%）洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1mL/min。洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物（相当于0.4g样品）用1mL 流动相定容，涡旋混合1min，过微孔滤膜后，供HPLC测定。
2.5.3 加标回收
对液态奶进行低、中、高浓度加标重复测定，三聚氰胺加标浓度分别为0.8μg/mL、2μg/mL、4μg/mL，分别测定5次进行分析。
图6 液态奶加标4μg/mL三聚氰胺标准溶液色谱图
表5 液态奶加标三聚氰胺标准溶液色谱参数
说明：液态奶中三聚氰胺加标浓度分别为0.8μg/mL、2μg/mL、4μg/mL，测定5次进行分析，计算得三聚氰胺相对标准偏差分别为1.09%、0.76%、0.88%，加标回收率分别为83.3%，88.8%，94.5%，满足《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》GB/T 22388-2008高效液相色谱法方法要求。
2.6 样品测试
取液态奶进行测试，经提取、净化操作后，经0.22μm的滤膜过滤。进样量取20μL上样分析，测试谱图如下所示。
图7 液态奶样品色谱图
说明：从检测结果可知，液态奶样品中未检出三聚氰胺，结果正常。
2.7 注意事项
1. 三聚氰胺属于2B类致癌物，在制备三聚氰胺相关溶液时需要注意佩戴好实验室防护用品；
2. 在制备三聚氰胺标准储备液时需用甲醇水溶液溶解并定容，配制过程中发现三聚氰胺标准品较难溶于甲醇水溶液中，需简单超声溶解后再进行定容，或50℃水浴加热溶解后定容至刻度；
3. 三聚氰胺标准储备液需在4℃避光保存，液相进样小瓶可选择棕色瓶。
3 结论
本次采用皖仪科技高效液相色谱仪LC3200系列配置紫外检测器，依据《原料乳与乳制品中三聚氰胺的测定方法》GB/T 22388-2008 高效液相色谱法。实验结果显示，三聚氰胺的线性良好，R值在0.999以上，三聚氰胺标准品色谱峰正常，理论塔板数在15000以上。三聚氰胺标准品重复进样6次，定性RSD值为0.165%，定量RSD值为0.356%，重复性较好。仪器检测限为0.0096μg/mL，定量限为0.032μg/mL。在回收率实验中，液态奶中三聚氰胺加标浓度分别为0.8μg/mL、2μg/mL、4μg/mL，测定5次进行分析，相对标准偏差分别为1.09%、0.76%、0.88%，加标回收率分别为83.3%，88.8%，94.5%。说明了该方法配备皖仪科技LC3200系列仪器满足原料乳和乳制品中三聚氰胺的检测需求。
