Nature | NINJ1细胞死亡研究领域新进展

使用NINJ1抗体抑制膜撕裂限制组织损伤

背景部分介绍：

NINJ1是一种16 kDa的细胞表面蛋白，预计具有两个跨膜区域，并且在细胞外部具有N和C端。虽然对细胞死亡的诱导是非必要的，但NINJ1控制着细胞凋亡或焦亡的一个重要后果，介导PMR （plasma membrane rupture），非选择性地从死亡细胞中释放促炎细胞质内容物。NINJ1依赖性PMR是否会加重疾病中的组织损伤尚不清楚，但据报道，在小鼠模型中，Ninj1缺乏可减轻肺纤维化和多发性硬化症。鉴于NINJ1的一个保守的细胞外区域对其寡聚化和PMR至关重要，作者假设细胞外抗NINJ1抗体可以用来抑制体内依赖NINJ的PMR。

在介绍本文内容前，推荐两篇相关的文献，希望为大家提供更好的背景方面的了解。

第一篇如下，NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death, 是由同一作者于2021年发表于nature的文章，初步描述了NINJ1在细胞焦亡过程中对质膜撕裂的作用。

第二篇，structural basis of NINJ1-mediated plasma membrane rupture in cell death, 巧合的是这篇文章与我们要解析的文章同一天发表在nature上，但作者不同。这篇文章详细解析了NINJ1的空间构象。

在NINJ1出现之前，大家普遍认为细胞焦亡过程中，细胞肿胀后引起的质膜撕裂是被动的，随着关于NINJ1在nature的三篇文章出现，相信大家对该基因的重要性有了共同认识，那么接下来NINJ1是否会成为细胞死亡领域里的研究新宠呢？

主要结果部分：

1.NINJ1阻断抗体克隆D1的鉴定

为了产生Ninj1阻断抗体，作者用表达全长小鼠NINJ1的细胞外囊泡免疫Ninj1−/−小鼠a。通过流式细胞术分析分离了大约15000个结合NINJ1的IgM−B细胞，并鉴定了单细胞上清与表达NINJ1的细胞的结合。217个重组抗小鼠NINJ1 IgG2a单克隆抗体的功能筛选鉴定克隆D1 (NINJ1- 575)为NINJ1依赖性PMR抑制剂b。另外验证了D1只结合鼠NINJ1 C。克隆D1识别NINJ1的C端表位，而对照克隆25识别N端表位d。

2. D1可有效抑制NINJ1依赖性PMR

为了扩展对BMDMs的分析，我们通过延时活细胞成像来监测NINJ1依赖性PMR。用异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的150 kDa葡聚糖(DD-150)装载Pam3CSK4-primed BMDMs，并使用尼日利亚菌素刺激后的染料释放量作为PMR的指标，发现克隆25和D1均表现出PMR阻断活性，但后者更有效a。虽然二者都能阻断PMR，但不能抑制膨胀泡的形成c。

3. 克隆D1减弱了NINJ1的寡聚化

假设克隆D1通过阻止NINJ1的寡聚化来阻断BMDMs中的PMR。为了与这种机制保持一致，尼日利亚菌素在野生型bmdm中诱导了NINJ1的斑点状组装，但这些在D1 Fab克隆存在时不那么普遍a, b。还检测了克隆D1对瞬时转染人Expi293F细胞纯化的n端flag标记小鼠NINJ1的影响。通过隔离层析(SEC)，纯化后的Flag-NINJ1作为高分子量的物种迁移(在8.5 ml保留体积时达到峰值)，相比之下，当Flag-NINJ1与克隆D1 Fab共表达时，纯化的NINJ1-Fab复合物以低分子量的物种迁移(在15ml保留体积时达到峰值)。c。另阴性染色电镜显示，Flag-NINJ1形成了形状各异的低聚结构，包括环状、长丝、团簇和圆弧，其尺寸可达200 nm，与D1 Fab共存在时无高阶低聚物结构形成d。

4. 克隆D1限制了NINJ1依赖性PMR和DAMP的释放

该实验采用了小鼠模型NINJ1fl/flRosa26-creERT2 mice: 该小鼠品系能够在成年鼠中引起他莫昔芬诱导的系统性NINJ1缺失。

a-d探讨了NINJ1在细胞凋亡相关PMR中的作用：

在他莫昔芬治疗后，NINJ1fl /flRosa26-creERT2小鼠和Rosa26-creERT2对照小鼠给予TNF和转录抑制剂D-半乳糖胺(D-Gal)诱导肝细胞凋亡，TNF +D-Gal引起Rosa26-creERT2小鼠的暴发性肝细胞PMR，血清中ALT、AST和LDH升高，而TNF + D-Gal处理的NINJ1缺陷小鼠血清中ALT、AST和LDH含量显著较低a。对照肝脏的组织学分析显示，TNF + d-Gal引起以收缩性肝细胞死亡伴出血为特征的大面积病变，NINJ1缺陷肝细胞表现出与PMR功能障碍相关的肿胀形态b, c。免疫标记显示，这些病变中裂解的caspase-3（细胞凋亡的标志）呈阳性d。这些数据表明NINJ1在体内介导凋亡相关的PMR。

接下来，检测克隆D1是否可以限制TNF + d-Gal诱导的肝损伤e-g：

野生型小鼠在注射TNF + D-Gal前2小时给予同型对照抗体，血清ALT、AST和LDH水平显著升高，表明肝细胞PMR增强，与NINJ1缺乏症类似，D1克隆预处理显著减弱诱导的血清LDH、ALT和AST升高e。随后发现TNF + D-Gal以NINJ1依赖的方式增加了血清中DAMPs IL-18和HMGB127的水平f, g。

模式图推测：

最后，针对文章的研究，小优博士在这里制作了一张推测的模式图，供大家参考。

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