1971 年，Judah Folkman 教授提出 “肿瘤生长和转移依赖于血管新生” 理论，认为新血管的形成对于肿瘤生长和转移至关重要。血管生成和细胞侵袭怎样设计实验？想要具体实验 Protocol？ 一文带你走进热门实验技术，为发表高分文献提供新思路，“胶”你做实验！
基底膜是一层特化薄而柔韧的胞外基质 (无细胞薄膜状结构)，位于上皮细胞基底面与深部结缔组织间。基底膜在发育和伤口愈合时会发生退化及再生，它不仅为细胞和细胞层提供支持，也为血管生成提供其所必需的环境，还是转移性肿瘤细胞侵袭的主要屏障。此外，基底膜还可通过影响细胞粘附、迁移、增殖和分化对组织形成产生重要作用[1]。
图 1. 间质基质和基底膜的组成[1]。
基底膜基质胶 (Basement Membrane Matrix) 是从富含胞外基质蛋白的小鼠肿瘤中提取出的天然基底膜基质，主要成分是各类生长因子及细胞外基质成分。
Tips!
基质胶主要细胞外基质成分有：层粘连蛋白 (Laminin)、IV 型胶原蛋白 (Col-IV)、巢蛋白 (Entactin)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖 (Heparan sulphate proteoglycans) 等。
基质胶也包含多种生长因子，例如：类胰岛素生长因子 (IGF-1)、转化生长因子 β (TGF-β)、血管内皮生长因子 (VEGF)、表皮生长因子 (EGF)、成纤维细胞生长因子 (bFGF) 等。
基于基底膜基质胶的组成及特性，基底膜基质胶对于体外模拟细胞体内生长环境提供了非常重要的支持，其应用包括免疫缺陷型小鼠体内肿瘤形成、类器官培养、肿瘤细胞侵袭实验、体外和体内血管生成研究、干细胞的维持、扩增和分化等。
MCE 基质胶产品适用多个研究领域，批次间稳定性高，部分产品如下：
肿瘤组织具有高度血管化的特征，肿瘤的生长依赖于新生血管。由于血管生成 (Angiogenesis) 对肿瘤生长和侵入转移、特别对肿瘤早期发生的重要影响，已成为近年来肿瘤研究的热点之一。
由于内皮细胞在基底膜提取物上培养时可形成三维毛细血管样管状结构，血管生成实验成为一种简单、定量、可靠且功能强大的模型，常用于研究抑制剂和激活剂对血管生成的影响。
▐【实验步骤】
1. 准备基质胶
实验前一天将 -20℃ 保存的基质胶埋于碎冰放入 4 ℃ 冰箱，使基质胶过夜缓慢融化。实验开始前，将基质胶放在冰盒中，将 96 孔板和 1 mL 枪头放置在冰上预冷，基质胶用预冷枪头混匀。
2. 铺基质胶
准备预冷的 1.5 mL 离心管用于稀释基质胶，以基质胶: DMEM 培养基为 1:1 或 2:1 的稀释比稀释。稀释后向 96 孔板每孔加入 50-80 µL 稀释后的基质胶，垂直加入避免产生气泡。在 37℃ 培养箱中放置 45 分钟~1 小时使基质胶凝固。
3. 铺细胞
使用 3-5 代状态较好的 HUVEC 细胞，消化细胞，用含 10% 血清的 DMEM 培养基重悬细胞并计数。96 孔板每孔加入 50-100 µL，3-5 万个细胞的重悬液，每组重复三孔。将 96 孔板置于 37℃ 培养箱培养，4-12 小时后可见血管形成。
4. 定量分析
使用 ImageJ 中 Angiogenesis Analyzer 插件对血管网络进行定量统计。
▐【结果示例图】
(A) Aspirin 对基质胶上 HUVEC 管形成的影响; (B) HUVEC 细胞血管形成实验应用 ImageJ-Angiogenesis Analyzer 分析 (绿色，分支；洋红，节段；蓝色包围的红色，接合处；青色，网格；紫色，锚定接合处)。
▐【注意事项】
1. 为什么基质胶液面不平有气泡？
铺胶时手持移液枪垂直于 96 孔板内孔的正上方垂直加入，防止基质胶沾到孔壁上。当刚加胶时出现明显的气泡，可使用吸头轻触戳破，后续摇平即可。若孔底部没有铺匀，可晃动孔板使其均匀铺于底部。
2. 成管时间怎么判断？
成管时间与细胞状态密切相关。细胞状态好时，2-3 小时开始成管，细胞状态较差时，可能 18-24 h 成管；如果使用原代内皮细胞而非永生化细胞，开始成管的时间会延迟几个小时；建议
实验每 4 个小时观察一次。
细胞侵袭 (Cell invasion) 是指细胞通过细胞外基质从一个区域迁移到另一个区域的能力，是正常细胞或癌细胞对化学和机械刺激做出的正常反应，通常发生在胚胎发育、血管生成、伤口修复、炎症反应、免疫反应和癌症转移等过程中。
图 3. Transwell 细胞侵袭试验示意图[4]。
在肿瘤相关研究中，利用 Transwell 小室检测肿瘤细胞的迁移和侵袭能力十分常见。在 Transwell 小室的聚碳酸酯膜上侧铺一层基质胶模拟细胞外基质，肿瘤细胞分泌基质金属蛋白酶消化基质进入下室，最后计算下室的细胞量即可反映细胞的侵袭能力。
▐【实验步骤】
1. 准备基质胶
实验前一天将 -20℃ 保存的基质胶埋于碎冰放入 4℃ 冰箱，使基质胶过夜缓慢融化。实验开始前，将基质胶放在冰盒中，将 24 孔板和 1 mL 枪头放置在冰上预冷，基质胶用预冷枪头混匀。
2. 铺基质胶
准备预冷的 1.5 mL 离心管用于稀释基质胶，以基质胶: DMEM 培养基为 1:8 的稀释比稀释 (根据细胞分泌基质金属蛋白酶的含量，稀释比例需要摸索)。取 60-100 μL基质胶添加到 Transwell 小室上层 (注意不要出现气泡)，于 37℃ 培养箱中孵育 3 h，使基质胶聚合成薄膜。孵育后将上室中多余液体吸掉，每孔加入 100 μL 无血清培养基后，于 37℃ 培养箱放置 30 min，进行基底膜水化。
3. 铺细胞
在 24 孔板下室加入 600 μL 含有 10% 胎牛血清的细胞培养基。消化细胞，用 PBS 清洗细胞，使用含有 BSA 的无血清培养基重新悬浮细胞，细胞计数调整细胞密度至 1-10×105个/mL (不同细胞大小和侵袭能力不同，可设置浓度梯度以达到
实验结果)。用镊子将 Transwell 小室置于 24 孔板内 (注意不要产生气泡)，取 100-200 μL 细胞悬液，加入 Transwell 小室上层。将 24 孔板置于 37℃ 培养箱培养 24-72 h (依照细胞侵袭能力而定)。
4. 结晶紫染色
弃去细胞培养基，24 孔板加入 500 μL 4% 多聚甲醛固定液固定 30 分钟，PBS 清洗。加入 500 μL 结晶紫溶液，染色 30 分钟，使用 PBS 清洗去除浮液。适当风干后即可进行显微镜观察、拍照和统计学分析。
▐【结果示例图】
图 4. MDA-231 细胞和 MDA-231-HM 细胞的侵袭实验[5]。
▐【注意事项】
1. 结晶紫染色后细胞分布不均一？
可能原因：Transwell 小室倾斜放置在孔板中；细胞消化不
；细胞悬液添加不均匀；基质胶胶面不均匀。
2. Transwell 小室下层细胞过少？
可能原因：细胞的侵袭能力弱；基质胶浓度偏高厚度偏厚；细胞接种数量少；Transwell 小室孔径偏小；Transwell 小室放入孔板时有气泡等。
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本期为大家介绍了血管生成和细胞侵袭的实验设计和注意事项，各位小伙伴们！或许你有其他想要了解的实验 Protocol？ 小 M 欢迎大家留言评论，安排您的 “专属” 实验操作指南或相关主题讲座喔~
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参考文献：
[1] Bonnans C, et al. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014 Dec;15(12):786-801.
[2] Dai X, et al. Aspirin Inhibits Cancer Metastasis and Angiogenesis via Targeting Heparanase. Clin Cancer Res. 2017 Oct 15;23(20):6267-6278.
[3] Carpentier G,et al. Angiogenesis Analyzer for ImageJ - A comparative morphometric analysis of "Endothelial Tube Formation Assay" and "Fibrin Bead Assay". Sci Rep. 2020 Jul 14;10(1):11568.
[4] Justus CR, et al. Transwell In Vitro Cell Migration and Invasion Assays. Methods Mol Biol. 2023;2644:349-359.
[5] Zhu Y,et al. Exosomal MMP-1 transfers metastasis potential in triple-negative breast cancer through PAR1-mediated EMT. Breast Cancer Res Treat. 2022 May;193(1):65-81.
