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【瑞士步琦】利用Pure C-850双模式进行辣椒素纯化分离

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2024/4/12 9:47:54

利用 Pure C-850 双模式

辣椒素纯化分离

Pure 应用


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介绍

辣椒素主要来源于辣椒属植物,不同种类的辣椒含有不同量的辣椒素,通常辣椒的辣度与其中辣椒素的含量有关。此外,一些其他植物也可能含有少量的辣椒素,例如胡椒、姜等。


 辣椒素结构式


辣椒素因其抗菌活性可用于生物膜和防污涂料,使其在食品包装、食品保鲜、海洋环境和牙科治疗等方面具有广阔的应用前景。辣椒素在代谢紊乱中也起着至关重要的作用,包括减肥、降压和降低胰岛素的作用。此外,辣椒素通过诱导细胞凋亡和抑制肿瘤细胞的增殖,对预防肺癌、胃癌、结肠癌和乳腺癌等人类癌症有效。先前的研究还表明辣椒素对缓解疼痛和认知障碍有积极作用。辣椒素是瞬时受体电位香草素 1 型 (TRPV1) 的激动剂,可选择性激活 TRPV1,诱导 Ca2+ 流入和相关的信号通路。最近,肠道菌群也参与了一些疾病的治疗,但其对辣椒素作用的影响仍有待深入研究。


在天然辣椒中同时存在辣椒素与二氢辣椒素,用硅胶柱层析或正相薄层色谱法(TLC)等传统方法分离这两个结构相似的化合物十分困难。即使用中压快速制备色谱(FLASH)分离纯辣椒素也非常困难,因此往往需要使用中压制备色谱法和高压制备色谱法进行两步纯化。在本次的应用文章中,我们将会展示如何利用两步分离从红辣椒原料中提取 HPLC 峰面积达 95% 以上的辣椒素。


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仪器、耗材与试剂

仪器:

  • 步琦 Pure C-850 中高压一体纯化分离系统

  • 步琦 E-800 索氏萃取系统

  • Agilent 1260 Infinity II 液相色谱分析系统

 Pure C-850 制备色谱系统

 E-800 索氏萃取系统


耗材:

  • VisionHT C18 3μm, 150 x 4.6mm

  • FlashPure Ecoflex Silica 12g

  • BUCHI PrepPure C18 100 Å, 10 µm, 250 x 20 mm


试剂与样品:

  • 市售红辣椒 10g

  • 去离子水 4L

  • 乙腈(HPLC 级)4L

  • 甲醇(AR 级)4L

  • 二氯甲烷(AR 级)4L

  • 乙醇(AR 级)1L

  • 辣椒素标样 99.5% 100mg


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实验部分

样品准备:

将市售红辣椒皮碾碎成粉状,取 5g 置于 E-800 索氏提取器的萃取腔内,溶剂杯内加入 100mL 乙醇,加热等级设定为 13 级,整个提取过程持续 4 小时,制成辣椒皮萃取液。


确认辣椒素峰位置:

HPLC 条件

色谱柱

VisionHT C18 3μm, 150 x 4.6mm

流速

1.5mL/min

溶剂 A

溶剂 B

乙腈

梯度

50% 等度,6 分钟

紫外波长

227nm







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 辣椒皮萃取液出峰图



根据辣椒素标样,我们可以确定辣椒素的出峰位置为 3.884 min,通过这一参数我们可以确认之后每一步分离的馏分位置。


辣椒素粗分离:

色谱条件(C-850 FLASH 模式)

色谱柱

FlashPure Ecoflex Silica 12g

平衡时间

6 分钟

流速

10 mL/min

溶剂 A

二氯甲烷

溶剂 B

甲醇

梯度

10% 等度,40 分钟

紫外波长

254nm; 227nm; 280nm

检测器灵敏度

上样量

600mg 红辣椒皮粉末

上样模式

干法上样


将 600mg 红辣椒皮粉末与 3g 硅胶拌匀,放入干法上样柱内进行上样,在 C-850 的中压模式下进行初步纯化分离。


 C-850 中压模式下分离红辣椒皮内的化合物


根据之前 HPLC 上辣椒素的出峰位置,我们大致判定目标化合物被收集在 9-11 管内,将这几管馏分合并后浓缩,进行 HPLC 检测。


 9-11 管馏分并管后 HPLC 检测图


通过 HPLC 分离后,可以看到除了 3.882 min 的辣椒素,在 5.365 min 还有一个化合物,这是与辣椒素结构相似的二氢辣椒素。


 二氢辣椒素结构式


中压模式下的色谱柱填料粒径通常为 30-50μm,很难将辣椒素与二氢辣椒素拆分开,因此我们需要将 C-850 切换至高压模式,利用粒径更小的高压不锈钢色谱柱分离这两个化合物。


获取高纯度辣椒素:

色谱条件(C-850 高压模式)

色谱柱

BUCHI PrepPure C18 100 Å, 10 µm, 250 x 20 mm

平衡时间

10 分钟

流速

15mL/min

溶剂 A

溶剂 B

乙腈

梯度

50% 等度,45 分钟

紫外波长

254nm; 227nm; 280nm

检测器灵敏度


将之前获取的 9-11 管馏分浓缩后,在 C-850 的高压模式下进行分离。


 样品粗分后 9-11 管馏分高压分离图


根据之前 HPLC 的出峰顺序,我们可以推测 21-26 管馏分为辣椒素,31-33 管馏分为二氢辣椒素,取 21-26 管分别进行 HPLC 检测。


 高压模式下 21-26 管馏分 HPLC 检测图


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结论

辣椒皮中含有多种化合物,仅通过柱层析色谱或中压制备色谱很难获得高纯度的单一化合物。步琦 Pure C-850 纯化分离系统支持中压和高压双模式,一台仪器就能完成大量样品的中压粗分富集与高压高纯度纯化,分离天然产物时具有明显的优势。在本次应用中,通过中压和高压的两次分离,最终 24 与 25 管馏分的峰面积能达到 95% 以上,可以进行下一步的生物活性测试。



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