一、保留值与分离度重现性不好原因分析
问题 | 原因 | 表现 |
不同色谱柱间差异使用期间柱变化 | 填料、键合相不同 柱床破坏 键合相丢失 硅胶基质溶解 强保留组分堆积堵塞 | 保留因子(k), 分离因子(a） 柱效(N） 保留因子(k), 分离因子(a） 柱效(N) 保留因子(k), 柱效(N) |
柱外效应 | 系统差异、进样量大、进样阀与色谱柱之间、色谱柱与检测器之间的管路太长、检测器流通池体积大、接头死体积大等。 | 柱效(N) |
分离效果变差 | 流动相组分改变 流速改变 温度改变 | 保留因子(k)，柱效变化很小 保留因子(k), 分离因子(a) 保留因子(k), 柱效变化很小 |
柱平衡慢 | 重新平衡时间不够 | 保留因子(k), 柱效变化很小 |
柱超载 | 样品量太大 | 保留因子(k), 柱效(N) |
二、造成色谱峰（ 不对称）拖尾的原因
1．色谱柱本身填装问题,筛板堵塞或填料塌陷；
2．柱头有污染；
3．样品超载；
4．样品溶剂不合适；
5．柱外效应；
6．化学或二次保留（硅羟基）效应；
7． 缓冲容量不足或不合适；
8． 重金属污染。
三、如何解决峰形拖尾的问题
A. 与化学有关的拖尾问题
1．流动相中，加入30mM的三乙胺（用于碱性化合物）或醋酸胺（用于酸性化合物）， 未知化合物加醋酸三乙胺；
2．如仍然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；
3.降低进样量至<1μg。
B. 与色谱柱有关的拖尾问题
1.如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用20倍柱体积的96%的二氯甲烷与4%甲醇，加1%氢氧化铵混合液冲洗；正向柱可用甲醇冲洗；
2.使用保护柱。
C. 与HPLC系统有关的峰拖尾和峰加宽
1.进样体积过大，（通常≤25μL）；
2.进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大（*连接管应<20cm，内径为0.007"）；
3.检测器流通池的体积过大。
四、如何贮存色谱柱
1.防止缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物,做到流动相用多少配多少, 或在水流动相中加200ppm的叠氮钠以抑制细菌生长（一定当心其毒性和潜在的爆炸性）；或在流动相中加20%的有机改性剂，也可抑制微生物生长， 有机改性剂还有助于流动相脱气。
2.尽可能将色谱柱贮存于100%有机溶剂（乙晴）中，避免在缓冲溶液中保存。
3.使用缓冲溶液后的色谱柱，应用15～20倍柱体积的不含缓冲剂的同种水-有机溶剂流动相冲洗色谱柱，后换成100%有机溶剂贮存。
4.避免用纯水冲洗键合致密的C18柱。
5.将色谱柱的两端用堵头拧好，以免柱床填料干裂。
