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【瑞士步琦】利用喷雾干燥实现mRNA-LNP的气管内递送

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2024/4/23 10:57:55

利用喷雾干燥

实现 mRNA-LNP 的气管内递送

喷干应用


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介绍

mRNA 疫苗是指将含有编码抗原蛋白的 mRNA 导入人体,直接进行翻译,形成相应的抗原蛋白,从而诱导机体产生特异性免疫应答,达到预防免疫的作用(图1)。


mRNA 疫苗的优势主要有:

  1. 研发周期短、抗原选择范围广,任何可成蛋白的抗原序列均可被选择

  2. mRNA 疫苗的半衰期与免疫原性可通过修饰和递送系统来人工调节,由于不进入细胞核,无感染或插入突变的风险,安全性更高

  3. 多种修饰后的 mRNA 更稳定,在细胞质中被高效摄取和表达;mRNA 疫苗具备自我佐剂特点,因此表现更强的免疫原性,有效性更高

  4. 可通过体外转录技术快速、廉价地大规模生产 RNA 疫苗,在掌了病毒基因序列后即可在 40 天内完成疫苗样品的生产制备


图1. mRNA 疫苗通过转染抗原呈递细胞引起免疫


  1. 注射的 mRNA 疫苗被抗原呈递细胞内吞。

  2. mRNA 脱离核内体进入细胞质后,被核糖体翻译成蛋白质。翻译的抗原蛋白可以通过几种方式刺激免疫系统。

  3. 细胞内抗原被蛋白酶体复合物分解成更小的片段,片段通过主要组织相容性复合体(MHC) I类蛋白在细胞表面展示给细胞毒性T细胞。

  4. 活化的细胞毒性T细胞通过分泌细胞溶解分子,如穿孔素和颗粒酶,杀死被感染的细胞。

  5. 此外,分泌的抗原可以被细胞摄取,在核内体内降解,并通过 MHC II 类蛋白在细胞表面呈递给辅助性T细胞。

  6. 辅助性T细胞通过刺激 B 细胞产生中和抗体,并通过炎症因子激活吞噬细胞,如巨噬细胞,促进循环病原体的清除。BCR:B 细胞受体;ER:内质网;TCR:T 细胞受体。


随着 COVID19 的全球大流行,mRNA 疫苗已经作为一种新兴的疫苗技术进入市场,LNPs 是目前 mRNA 递送时克服体内给药时的许多胞外和胞内屏障的载体。然而大多数 LNP mRNA 疫苗需要严格控制的冷链基础设施。喷雾干燥是一种快速、可扩展且连续的过程,可生产室温稳定且适合吸入的细粉,并可以通过喷雾干燥工艺参数来控制粉末的物理性质。但喷雾干燥过程中,LNP 也要承受剪切应力、液体界面膨胀和收集过程中热脱水引起的应力。以下分享阿斯利康应用 BUCHI 小型喷雾干燥仪 B-290 实现脂质纳米颗粒实现对 mRNA 的气管内递送。


小型喷雾干燥仪 B-290




▲ 小型喷雾干燥仪 B-290


干燥参数


_

入口温度

90℃

出口温度

54℃

抽气机效率

100%

雾化气流

1850 L/h

进料速率

2mL/min


2



方法

该团队首先关注了磷脂和缓冲液对 LNP 本身温度敏感性的影响。由于 DSPC 的相变温度(Tm)为 55℃,接近喷雾干燥器的出口温度,而 DOPE 是一种不饱和磷脂,Tm 为 -16℃,可改善LNP的温度敏感性,并有研究发现 DOPE 替代 DSPC 可以提高 mRNA 递送效率[1]。LNP 中可电离脂质的 pKa=7,因此 pH 值的大幅变化可能会导致颗粒结构和稳定性的变化,该团队测试了广泛使用的 PBS 和 20 mM Tris 缓冲液的影响。该团队将四种不同的 LNP 配方(DSPC PBS;DSPC Tris;DOPE PBS;DOPE Tris)在不同温度范围孵育以模拟LNP配方和喷雾干燥过程的温度跨度。发现 DOPE Tris 组在高达 75℃ 的温度下仍保持稳定,并且在 80℃ 时仅损失约 20% 的 RNA。


在喷雾干燥的温度条件下更稳定不等于能更好地承受喷雾干燥过程,因此该团队还验证了 DOPE Tris LNP 能更好地承受喷雾干燥过程。DOPE Tris 组在喷雾干燥和复溶 306Oi10 和 MC3 LNP 时均增强了颗粒稳定性。 Tris 缓冲液在喷雾干燥方面优于PBS,虽然两种缓冲液的 pH 值都会随着温度的升高而降低,但 Tris 的变化率比 PBS 快 10 倍,这意味着Tris缓冲液从 25°C 升至 37°C 时 pH 将减少 0.3 个单位,而 PBS 仅减少 0.025 个单位,pH 值的降低可能会确保RNA仍被封装在LNP中。作者还发现优化的LNP配方(DOPE Tris)显著提高了评估了 LNP 在肝细胞癌细胞系 HepG2 和肺支气管细胞系 16HBE 中的摄取,与 4°C 下储存的液体 LNP 制剂相比,通过喷雾干燥处理并在室温下储存的 LNP 具有更好的稳定性、更高的颗粒封装效率以及更显著的蛋白质表达(图2)。


▲ 图2. 通过修改配方,以 DOPE 代替 DSPC、Tris 缓冲液代替 PBS,可以提高喷雾干燥后 LNP 的稳定性


(A) 使用 DSPC 和 PBS 生产的 LNP 制剂对温度升高敏感


(B) 当 DSPC 替换为 DOPE、PBS 替换为 Tris 时,喷雾干燥和重新分散后LNP颗粒的稳定性显著提高。


(C) LNP 制剂在喷雾干燥(SD)后稳定性提高,导致  mRNA 对 HepG2 和 16HBE 细胞具有良好转染效率。比例尺=100μm。**P<0.01、***P<0.001、****P< 0.0001、n.s=不显著。


该团队发现,当喷雾干燥 LNP 制剂时,在干燥塔内可观察到均匀的薄膜,在旋风分离器中可观察到薄膜沉积物,这是因为在无赋形剂的情况下,喷雾干燥 LNP 制剂中每种成分的固化机制将根据其扩散速率和溶解度而有所不同,引起各组分分离。因此该团队优化了 LNP、海藻糖、三亮氨酸的比例[2]。发现 LNP 与三亮氨酸的比例为 1:4 至 1:5 时,可以减少旋风分离器中的粉末损失,并进一步提高复溶后的 mRNA 封装效率,将 LNP 负载从 1.5% 增加到 5%。喷雾干燥后,通过 SEM 分析粉末粒径和表面结构,通过 CryoTEM 分析复溶的颗粒。发现喷雾干燥后复溶的 LNP 样品为尺寸范围变化更大的致密小囊泡(图3)。


 图3. 喷雾干燥配方的优化


(A) 粉末配方中三亮氨酸(LLL):LNP 比例的优化可将旋风分离器中的损失降至zui低,并随着重构后 RNA 封装效率 (%EE) 的增加而实现产量zui大化。


(B) 喷雾干燥产生 LNP 的扫描电镜照片。当三亮氨酸(LLL)的浓度从 3% 增加到 15% 时,颗粒的形态逐渐从光滑的表面变成高度波纹状的表面。


(C) 新制 LNP 和喷雾干燥 LNP 代表性冷冻透射电子显微镜图片。与新鲜 LNP 相比,喷雾干燥 LNP 复溶后被包裹在致密的衬里。比例尺 =200nm。 


接下来,该团队验证了 mRNA LNP 粉末制剂在体内的功能性递送。使用 Penn-Century Dry Powder Insufflator™-4 装置对动物进行给药,该装置可以将粉末直接输送到大鼠的肺部。肺组织切片上的免疫组化(IHC)显示出强烈的 eGFP 阳性细胞染色。这些细胞根据其定位、形态和免疫荧光标记被鉴定为细支气管上皮细胞、II 型肺细胞和/或巨噬细胞。尽管仅识别出少数 eGFP 阳性细胞,但这些阳性细胞的染色强烈、且无背景噪点,表明 eGFP mRNA LNP 在喷雾干燥后吸入给药,可在肺部产生清晰的 eGFP 表达。


 图4. 肺中的体内摄取和蛋白质表达


(A) 大鼠肺示意图


(B) 研究设计的示意图。

单次给药后 24 小时或连续3天每日给药后 24 小时处死大鼠。给药方式包括气管内(IT)滴注含有 eGFP mRNA LNP 的喷雾干燥制剂或安慰剂。


(C) 在右肺叶的肺匀浆中测量的 eGFP 蛋白水平


(D) 显示 eGFP 阳性细胞(紫色)的图像


(E) IT 滴注单次(I和III)和 3 天重复(II和IV)给药后 24 小时在大鼠左肺叶中检测到的 eGFP(棕色)。eGFP 阳性细胞(紫色)形态学上鉴定为细支气管上皮细胞 (D I) 和 II 型肺细胞和巨噬细胞 (D II)。在细支气管上皮细胞(E I)和 II 型肺细胞和巨噬细胞(E II)中鉴定出 eGFP mRNA (棕色)。


(F) eGFP 的免疫荧光标记与 II 型肺细胞或巨噬细胞标记物结合,证实两种细胞类型都表达 eGFP。


(G) 左肺叶的组织病理学分析结果。

左上:来自对照大鼠的肺组织,显示没有bing变。

左下:治疗 3 天的大鼠肺组织,显示肺泡实质中的实变区域,代表炎症病变(箭头)。

中图:混合炎症细胞浸润区域的较高放大倍数,以较小的气道和描绘肺泡管为中心。

右图:代表次级细支气管上皮变化的图像。


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结论

总的来说,该研究团队进行了一项概念验证研究,并成功通过配方优化,设计出了用于吸入的 mRNA LNP 喷雾干燥制剂。该制剂在经过喷雾干燥和复溶后仍保持功能,并可在体外和体内有效递送 mRNA,能够以临床相关剂量水平实现 LNP 的肺部给药,在吸入式 mRNA 疫苗领域开辟了新道路,具有巨大前景。


小型喷雾干燥仪 S-300




 小型喷雾干燥仪 S-300

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参考文献

  1. Chaudhary, N., Weissman, D. & Whitehead, K.A. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation. Nat Rev Drug Discov 20, 817–838 (2021).

  2. Friis K P, Gracin S, Oag S, et al. Spray dried lipid nanoparticle formulations enable intratracheal delivery of mRNA[J]. Journal of Controlled Release, 2023, 363: 389-401.



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