蛋白磷酸化是一种非常重要的翻译后加工，做信号通路必然是要检测蛋白磷酸化的，Western blot是评估蛋白磷酸化状态的常用方法，其实和跑正常蛋白没什么出入，只不过孵育的是识别磷酸化的抗体。下面恒远生物带大家总结一下实验中的注意要点。
一、关于磷酸化蛋白样品
裂解液问题蛋白的磷酸化是一个非常迅速的反应，取样品的过程要迅速，样品要新鲜，样品处理最好在冰上操作，操作时间尽量短。用PBS洗涤细胞时，PBS一定要4℃预冷。如果是组织的话，提取蛋白时采用液氮研磨的方法，研磨器具最好提前预冷，保持低温的状态。
提取磷酸化蛋白的裂解液最好是新鲜配制，裂解液中一定要有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，否则即使条带压出来也会很浅，结果也不可信。okadaic acid，NaF是磷酸酶抑制剂。再者，还要看你检测的蛋白磷酸化位点是什么氨基酸。
二、关于WB时背景和条带的问题
磷酸化蛋白WB时背景也往往较深，所以压片时间要适当，不能太长或过短，太长则背景太深盖住想要的那条带，时间过短则可能没有条带或者条带太浅。做磷酸化蛋白WB时，除了目标蛋白的条带以外，往往会出现非特异性的条带。磷酸化抗体不好的话，甚至会压出非特异性的条带，反而没有你想要的条带，所以压片后，一定要根据Markers比对一下你压出的条带分子量是否正确。
三、关于蛋白总的表达量问题
研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量。这有两种方法，一是：相同的样品在不同的孔中上样两次（可在相同的胶上，也可在不同的胶上），其一压磷酸化蛋白，另一压该蛋白总的表达量（包括磷酸化和未磷酸化的该蛋白），甚至还可跑另一个胶，压内标。但是一般不建议如此做，因为这样比较时误差还是较大的。因此，比较常用的方法，即用strip液将原先结合上的磷酸化抗体及二抗洗去，然后用同一张膜压总蛋白。然后再洗脱一次，再压内标。
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