中华人民共和国国家标准
GB 5009.285-2022
食品安全国家标准 食品中维生素B12的测定
前言
本标准代替GB 5413.14-2010《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定》。
本标准与GB 5413.14-2010相比，主要变化如下：
——增加了第一法液相色谱法；
——增加了第二法液相色谱-质谱法；
——删除了规范性引用文件；
——修改了原微生物法为第三法。
1范围
本标准规定了食品中维生素B12的测定方法。
第一法液相色谱法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品、肉及肉制品中维生素B12的测定。
第二法液相色谱-质谱法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品、肉及肉制品、即食谷物、烘焙食品、果冻、饮料中维生素B12的测定。
第三法微生物法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品中维生素B12的测定。
第一法 液相色谱法
2原理
试样经酶解后，用氰化钾（或氰化钠）溶液将钴胺素异构体（羟钴胺素、甲钴胺素和5-脱氧腺苷钴胺素等）转化为氰钴胺素。样液通过免疫亲和柱净化、浓缩后，反相液相色谱柱分离，紫外检测器检测，外标法定量。
3试剂和材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1试剂
3.1.1无水乙酸钠（CH3COONa）。
3.1.2乙酸（CH3COOH）。
3.1.3甲醇（CH3OH）：色谱级。
3.1.4 乙睛（CH3CN）：色谱级。
3.1.5三氟乙酸（CF3COOH）：色谱级。
3.1.6氰化钾或氰化钠（KCN/NaCN）。
3.1.7胃蛋白酶（CAS号：9001-75-6，活力≥400 U/mg）。
3.1.8淀粉酶（活力≥50 U/mg）。
3.1.9乙 醇（C2H6O）。
3.2试剂配制
3.2.1乙醇溶液（25%）：量取250 mL乙醇，加水稀释至1 000 mL，混匀。
3.2.2乙酸钠缓冲液（0.25 mol/L）：称取20.5 g无水乙酸钠，用950 mL水溶解并用乙酸调pH至4.0±0.1，用水稀释至1 000 mL。
3.2.3氰化钾（或氰化钠）溶液（10 mg/mL）：称取1.0 g氰化钾（或氰化钠）固体，加适量水溶解，并用水稀释至100 mL。
注：氰化钾（或氯化钠）为剧毒化学品；操作者须带防护用具，在通风橱内进行氰化钾（或氰化钠）溶液的配制或使用。
3.2.4三氟乙酸溶液（0.04%，体积比）：量取500 mL水，加入200 μL三氟乙酸，混匀。
3.3 标准品
维生素B12（氰钴胺素）标准品（C63H88CoN14O14P，CAS号：68-19-9）：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。
3.4标准溶液配制
3.4.1 维生素B12标准储备液（1 mg/mL）：称取10 mg（精确至0.01 mg）维生素B12标准品于50mL烧杯中，用乙醇溶液溶解后，转移至10 mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，摇匀，转移至棕色试剂瓶，于-20℃下避光保存，有效期6个月。
3.4.2维生素B12标准工作液（10 1rg/mL）：吸取1.00 mL维生素B12标准储备液，置于100 mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度。转移至棕色试剂瓶中，于4℃下避光保存，有效期1个月。
3.4.3维生素B12标准系列工作溶液：准确吸取标准工作液30 μL、60 μL、90 μL、150 μL和200 μL，分别置于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度。其浓度分别为：30 ng/mL、60 ng/mL、 90 ng/mL、150 ng/mL和200 ng/mL。临用现配。
3.5 材料
3.5.1维生素B12 免疫亲和柱，柱容量≥800 ng，柱回收率≥85%（验证方法参见附录A）。
3.5.2玻璃纤维滤纸。
3.5.3 微孔滤膜：水相，0.22 μm。
4仪器和设备
4.1液相色谱仪：带紫外检测器。
4.2 天平：感量为0.01 g、0.001 g和0.00001 g。
4.3pH计：精度0.01。
4.4水浴恒温振荡器：温度范围25℃~100℃。
4.5超声波清洗器。
4.6 离心机：转速≥10 000 r/min。
5分析步骤
注：操作过程应避免紫外光照，并尽可能避光操作。
5.1样品前处理
5.1.1试样制备
固体样品粉碎、研磨，或用绞肉机制成食糜，均质混匀。液体样品试验前振摇混匀。
5.1.2样品提取
称取5 g~10 g试样（精确至0.01 g）于150 mL.具塞锥形瓶中，依次加入30 mL乙酸钠缓冲液、0.2 g胃蛋白酶、0.05 g淀粉酶和2 mL氰化钾（或氰化钠）溶液，充分混合。将样品溶液放入水浴恒温振荡器，在37℃，酶解30 min（肉类样品酶解10 h~16 h），酶解后转入100℃水浴中，保持30 min，取出冷却至室温。将样品溶液转移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。移取上述溶液40 mL至50mL离心管中，在10000r/min下离心10min，取上清液用玻璃纤维滤纸过滤后备用。
注：对于以氰钴铵素为营养强化剂，且本底中不含有其他形式钴胺素的样品，在样品提取时可不使用氰化钾（或氰化钠）。
5.1.3净化
将免疫亲和柱连接至固相萃取装置上，弃去免疫亲和柱内的缓冲液后，移取适量上述滤液（其中含维生素B12为10 ng~500 ng）过柱，调节过柱速度为2 mL/min~3 mL/min。 待样液完全过柱后，用10 mL水以稳定流速淋洗免疫亲和柱，抽干。在免疫亲和柱下放置10 mL玻璃试管，用3 mL甲醇分3次洗脱，收集全部洗脱液，在60℃以下用氮气流缓缓吹至近干，用0.04%三氟乙酸溶液定容至1.0mL，涡旋30s溶解残留物，0.22μm滤膜过滤，待测。
注：氰化钾（或氰化钠）废液严禁与酸混合，可加入氢氧化钠调节pH>10，再加入高锰酸钾粉末（按废液质量的3%加入），使氰化物分解，放置24 h后排放。
5.2液相色谱参考条件
5.2.1色谱柱：C18柱（柱长 150 mm，柱内径4.6 mm，填料粒径2.5μm），或相当者。
5.2.2流动相：A 相，0.04%三氟乙酸溶液；B相，乙腈。
5.2.3梯度洗脱：0 min~6.0 min，90% A；6.0 min~8.5 min，90% ~0% A；8.5 min~ 14.0 min， 90% A。
5.2.4流速：0.8 mL/min。
5.2.5柱温：40℃。
5.2.6进样体积：100 μL。
5.2.7检测波长：361 nm。
5.3标准曲线的制作
将标准系列溶液由低浓度到高浓度依次注入液相色谱仪中，测定相应的色谱峰面积，以维生素B12的峰面积为纵坐标，以维生素B12的浓度为橫坐标绘制标准曲线。液相色谱图见附录B中图B.1。
5.4样品测定
将待测样液注入液相色谱仪中，得到待测溶液中维生素B12的峰面积，根据标准曲线得到测定液中维生素B12的浓度。待测样液中维生素B12的响应值应在标准曲线的线性范围内，超过线性范围则应稀释上机溶液，或调整取样量重新按样品分析步骤处理后再进样分析。
5.5空白试验
不称取试样，按样品分析步骤操作，应不含有干扰待测组分的物质。
6分析结果的表述
试样中维生素B12（以氰钴胺素计）的含量按式（1）计算：
式中：
X——试样中维生素B12的含量，单位为微克每百克（μg/100 g）；
ρ——由标准曲线得到的试样溶液中维生素B12的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V1——样品提取液的定容体积，单位为毫升（mL）；
V2——试样过柱洗脱液的最终定容体积，单位为毫升（mL）；
100——换算系数；
m——试样的取样量，单位为克（g）；
V2——上柱溶液的体积，单位为毫升（mL）；
1 000——换算系数。
计算结果保留两位有效数字。
7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
8 其他
当取样量为5.00 g时，婴幼儿食品和乳品、肉与肉制品的检出限为0.2μg/100 g，定量限为0.5μg/100g。
