技术文章

近年来，通过输注免疫细胞或干细胞进行相关疾病的治疗取得良好疗效，细胞治疗技术展示出越来越广阔的临床应用前景。通常细胞从采集到临床应用会间隔很长时间，而新鲜细胞产品保存时限较短，为了延长细胞保存时限或长期保存细胞产品，需要对细胞进行冷冻后储存。

细胞冷冻保存的原理

细胞冻存是通过冷冻保护机制将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，保持细胞活性，以便长期储存的一种技术。细胞复苏后，蛋白质仍有活性，细胞的结构和功能仍完好。

随着温度降低，细胞内外的水分都会结晶，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏，特别是0~-20℃的阶段，冰晶呈针状，极易引发细胞损伤。在不加任何保护剂条件下直接冻存细胞时，细胞内外环境中形成的冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等，引起细胞死亡。

如果在细胞溶液中加入冷冻保护剂，可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂容易同水分子结合，降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结形成冰晶前透出细胞，并且通过降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温（液氮）条件下保存。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关，且不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。

细胞冷冻保护剂

细胞冷冻保护剂可以根据否穿透细胞膜分为渗透性和非渗透性两种。渗透性冷冻保护剂可以透过细胞膜渗透到细胞内，多为小分子，包括二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、甲醇、乙醇等，这类保护剂能够在细胞冷冻悬液凝固之前，穿过细胞膜渗透到细胞内，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。DMSO是临床级冻存保护剂中重要的成分，目前经典的冻存保护剂中通常含有10%左右的DMSO。DMSO是常用的冻存保护剂和常用药用辅料，在国家药品监督管理局药品审评中心药用辅料数据库可以查询到其详细信息。非渗透性冷冻保护剂一般是一些大分子物质，不能渗透到细胞内，主要包括右旋糖苷、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白等，其可以优先同溶液中的水分子相结合，使冰点降低，减少冰晶的形成。由于其分子量大，可以使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤，同时能降低溶液中低分子溶质（电解质）浓度，减轻盐损伤。

细胞冷冻保存的一般流程

细胞冻存过程要缓慢，复苏则相反，应快速升温。慢冻的原因如上所述，为了避免降温时，细胞内的水分还未来得及脱离细胞，但却形成冰晶，对细胞造成损伤。（1）冻存前观察细胞状态，测定细胞活率和计数。（2）将要冻存的细胞收集于离心管中，1200~1800rpm，离心5min，弃上清。（3）根据需要调整细胞冻存密度，缓慢加入适当体积配制好预冷的冻存液或市售的无血清细胞冻存液，重悬细胞。（4）将细胞悬液分装至冻存管中，旋紧管盖，做好标记。（5）将冻存管放入程序降温盒（预冷）内，然后放至-80℃冰箱过夜，次日转移至液氮罐中长期保存。

如何选择细胞冻存液

细胞冻存液的质量和成分对细胞的冻存效果有很大的影响。如果细胞冻存液的成分不合适或质量不达标，可能会导致细胞冻存失败或细胞复苏后存活率低。

选择细胞冻存液时，应考虑以下3个重要因素：

（1）细胞类型，不同的细胞类型对细胞冻存液的成分和浓度有不同的要求。

（2）冻存时间，细胞冻存的时间越长，对细胞冻存液的要求越高。

（3）复苏率，细胞冻存液的质量和成分对细胞的复苏率有很大的影响。

下面给你介绍下李记生物~李记生物细胞冻存液的主要产品：

• 药辅级细胞冻存液（非程序降温）

• 快速细胞冻存液（GMP级）

• 无血清细胞冻存液（无DMSO）

• 无血清细胞冻存液（增强型）

• 快速细胞冻存液（无血清、无蛋白）

一、快速细胞冻存液（无血清、无蛋白）

和元李记快速细胞冻存液（无血清、无蛋白）可适应于绝大部分肿瘤细胞和常规细胞，大部分干细胞（和元李记已测试细胞种类请关注），冻存细胞可在 -80℃ 长期保存（＞6年）。不含动物源性蛋白，不含血清成分，可有效减少各类细菌、病毒和支原体等污染，保证冻存细胞的安全。该冻存液含DMSO、葡萄糖等各种细胞营养成分，提高细胞存活率和活力，亦适合于无血清培养细胞和蛋白表达细胞。

产品优势

1. 无需程序性降温，可直接将细胞放入冻存液置于-80℃冰箱（-80℃可保存＞6年），冻存液无需稀释。

2. 冻存液不含血清，大大降低细胞污染可能性。

3. 不要加血清，不要反复逐级降温，不要液氮，综合下来省时更省钱。

4. 案列可于-资源支持查询！

5. 各细胞冻存数据，可参考下方李记冻存液数据库（数据由使用客户反馈）

产品组分

运输与保存

常温运输。4℃保存，有效期24个月。

二、无血清细胞冻存液（无DMSO）

产品描述

李记生物无血清细胞冻存液（无DMSO）适用于多种细胞的冷冻保存，尤其适用于原代肝细胞、神经细胞等的冻存。

订购信息

产品参数

运输与保存

蓝冰运输。4℃密封保存，有效期12个月。

三、无血清细胞冻存液（增强型）

产品描述

李记生物无血清细胞冻存液（增强型）适用于常用动物细胞系的冷冻保存，尤其适用于原代细胞、干细胞等的冷冻保存。

订购信息

产品参数

运输与保存

蓝冰运输。4℃密封保存，有效期24个月。

四、快速细胞冻存液（GMP级）

产品描述

和元李记快速细胞冻存液（GMP级）不含动物源性蛋白，不含血清成分，可有效减少各类细菌、病毒和支原体等污染，保证冻存细胞的安全。通用于各种动物细胞株，尤其适用于各类原代细胞、干细胞及杂交瘤等蛋白表达细胞的冻存。

本产品含多种保护剂、稳定剂组合，可显著降低冻存过程中溶液冰点，提高细胞膜对水的通透性，有效防止冰晶对细胞的损伤；同时降低冰冻时细胞周围电解质浓度，避免电解质损伤；还可延缓冻存过程中细胞的互相挤压，保护细胞膜。从而极大提高细胞复苏率和活力。

产品优势

1. 便捷：即用型，无需程序性降温，可直接将细胞放入冻存液置于-80℃冰箱，也可在后续转移至液氮中进行长期保存。

2. 高效：细胞存活率和复苏活力高，普遍高于90% 。

3. 安全：无血清，无动物源成分，化学成分明确，大大降低细胞污染可能性。

4. 质优：严格的质量控制，产品性能媲美进口；所有原料均选自经严格检测的低内毒素、高纯药用级别原料，采用低DMSO配方，注射用水配置符合GMP生产。

5. 批间差异小：全程于GMP洁净车间生产与包装，并经过严格的内毒素、渗透压、 PH、细菌病原体等质量检测，确保产品质量及批次间的一致性。

6. 适用范围广：通用于各种动物细胞株，尤其适用于各类原代细胞、干细胞及杂交瘤等蛋白表达细胞的冻存；已通过实验证明不不会影响干细胞表型和生长状态，且可维持干细胞的多分化性。

7. 案列可于-资源支持查询！

产品组分

运输与保存

蓝冰运输。4℃保存，有效期12个月。

五、药辅级细胞冻存液（非程序降温）

产品描述

药辅级细胞冻存液（非程序降温）是由李记生物自主研发的含有7.5% DMSO，无血清、无动物成分的即用型细胞冻存液，在超低温（-80℃～-196℃）环境下为细胞提供一个安全、有效的保护环境，冻存复苏后细胞活率可达90%以上。

本产品含有甘氨酸，DMSO以及磷酸盐缓冲液的水溶液，适用于间充质干细胞的冷冻保存。

订购信息

产品参数

运输与保存

蓝冰运输。4℃密封保存，有效期24个月。

本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。