标题：A beginner's guide to study extracellular vesicles in human bloodplasma and serum.
期刊：Journal of Vesicles Extracellular
发表时间：2024年1月9日
摘要
血液是获取和研究细胞外囊泡(EVs)最为常见的体液。目前血液在临床分析中应用广泛，而血液来源EVs的研究更加的复杂。在2022年由国际细胞外囊泡协会在芬兰举办的血液细胞外囊泡研讨会上，意识到初学者研究人员可能缺乏对血液外泌体研究的相关经验，难以在研究中避免常见的问题。本篇指南旨在解释血液的组成和常用术语，提供了血液采集、血浆和血清制备的指南，并介绍了在考虑血液其他影响因素的情况下分离和检测血液EVs的原理。希望通过这份指南，为初学者研究人员提供简明、有据可依的指导说明，使其更好地了解当前关于研究血液EVs的知识和可用资源。
研究内容
一、血液组成
图1 血液组成示意图
血液是一种复杂的体液，更确切地说是液体形式中的组织基质，通过离心分层血液能够分成三个组分（图1）：血浆层（最上层）、缓冲层（中间层）、红细胞层（下层），其中血浆层主要是水(≥90%)，还包括蛋白、血小板、细胞碎片、EVs，缓冲层包含大部分的血小板和白细胞，底层为红细胞沉淀。EVs在血液中占比极低，其中血液中的外泌体主要来源于血细胞，其次是与血液接触的血管内皮细胞，而来自组织和器官的EVs含量很低，而检测这类低浓度EVs主要基于EVs生物标志物的研究。
图2 健康人类血液细胞、EVs、脂蛋白物理特性
二、血液EVs研究的难点
由于血液中存在大量血细胞，目前血液EVs研究通常以血浆或者血清为起始材料，而研究血浆或血清的EVs亦存在以下难点：
1. 血液中的EVs的产生和清除总是保持平衡，EVs也会黏附在红细胞或管壁被内化，因此提取的EVs难以反映血液循环中的真实EVs水平；
2. 脂蛋白在大小和/或密度上与EVs重叠，且在血液中含量较高，传统方法难以分离脂蛋白和EVs；
3. 血小板易被活化，释放外泌体，改变初始血液中内源外泌体组成；
4. 血液中存在非球型或低密度细胞残留物，离心后无法与EVs进行分离，并且在形态上也有相似膜结构；
图3 A为凝血途径以及血小板激活机制；B为血细胞来源EVs检测
血清样本血细胞来源EVs相较于血浆样本显著上升。特别凝血过程中导致的血小板激活引起血小板来源EVs含量的上调；血清中EVs的检测结果受血清管类型以及从采血到制备血清的间隔时间影响。
三、人类血浆和血清制备指南
供血者
1. 匹配对照组：使用在年龄、性别、药物等方面匹配的对照组进行准确的比较；
2. 采集时间：如果可能的话，尽量在同一天的同一时间采集血液，以减小变异；
3. 排除初始血液：排除从EV研究中收集的头2-3mL血液，使用像EDTA管这样用于血液学分析的试管，以避免干扰；
4. 静脉穿刺指南：遵循临床静脉穿刺指南，包括针尺寸、使用停滞法以及监测血流直到最后一个试管，因为在收集多个试管时血液可能会激活甚至开始凝结；
5. 禁食的影响：过夜禁食有助于降低脂蛋白的浓度；
6. 标准化：标准化血样收集和处理的所有步骤，以减小患者和健康对照之间可能影响血液EV和样本质量的系统差异。
抗凝
1. 抗凝剂的选择：不同的抗凝剂对凝血和血小板激活有不同的影响。考虑与下游分析的兼容性，例如肝素由于结合DNA而抑制PCR反应；
2. 血小板抑制：一些抗凝剂(ACD、EDTA)有效地抑制血小板激活，从而减少在血液收集和处理过程中释放的血小板源性EV；
3. 血清与血浆的区别：认识到血清样本与血浆样本之间存在差异，尤其是在血小板源性EV方面的影响；
4. 避免混合样本：不要混合不同抗凝的样本或血浆和血清样本。
四、血浆和血清的制备
图4 血浆、血清制备技术流程
1. 两步离心（采集距离白细胞层或凝块远一些的位置，降低血小板残留）；
2. 标准化制备程序：血浆血清制备统一标准化所有献血者的处理时间和抗凝剂；
3. 弃掉不透明（含脂肪）、橙色或红色（溶血），或含有明显的团块（抗凝不充分）的血浆或血清样本；
4. 血小板对冷激活敏感，勿将装有血液的试管放在冰上或冰箱中，应在室温下进行所有程序；
5. 尽可能保证使用相同的离心机、转子、使用条件，建议测量血小板浓度来检测血浆/血清的质量；
6. 使用聚丙烯材料收集血浆，使用玻璃管或者商业血清收集管收集血清。
研究结论
这篇文章提出的指南强调标准化、对供血者变量的谨慎考虑以及适当的处理程序，以确保从人类血浆和血清中获得可靠和可重复的EV研究结果。
