AD背景介绍
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种发病原因不明、发病机制复杂的原发性脑部神经性疾病，是最为常见的痴呆类型之一。临床主要表现为进行性记忆力下降、认知功能障碍、行为异常和人格失常等。其典型的病理改变包括神经元丢失、β-淀粉样蛋白(amyloid β-protenin, Aβ)沉淀形成的老年斑(senile plaque, SP)及tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结(neurofibrillary tangle, NFT)等[1]。随着人口老龄化进程的不断加剧，AD已成为国内外关注的热点和焦点。
图1 a)健康大脑；b)AD大脑中的大脑和神经元的生理结构[2]
AD建模方法
目前常用的AD动物模型的制备思路主要以体现AD病理、生理、临床表现特征为导向，模拟AD病理特征制备模型是研究AD的重要手段。AD动物模型的建立方法主要包括衰老模型、转基因模型、外源性有害物质注入模型等(表1)。例如，研究人员建立了脑内直接注射Aβ以诱发Aβ沉积的老年斑为特点的AD模型。目前主要注射的Aβ为Aβ1-42、Aβ1-40以及Aβ25-35，注射部位主要为单/双侧海马CA1区或者侧脑室，注射时间可从3天到数周不等[3-4]。其中，Aβ1-42是AD病理学研究的主要形式，它形成的核（种子）启动了纤维的形成，导致了经典的淀粉样变性过程。
表1 常用AD动物模型的优缺点比较
诱导原理 | 模型 | 优点 | 缺点 |
衰老 | 自然衰老型 | 模型脑内神经元萎suo、胆碱能功能低下、认知障碍。 | 老龄动物难以大量获得、极少神经元纤维缠结及淀粉样蛋白沉积、造模时间长。 |
快速老化型(SAM) | Aβ沉积、葡萄糖代谢的三羧酸循环异常、免疫功能障碍。 | 成本高、寿命较短。 | |
D-半乳糖(D-gal)模型 | 价格低廉、神经元丢失、蛋白质合成减少、学习记忆障碍。 | 不能产生AD有的老年斑和神经缠结、不确定因素较多 | |
转基因 | APP转基因型 | 细胞外Aβ的沉积、神经炎斑块、神经元突触丢失。 | 无tau蛋白磷酸化及NFT，无AD海马及皮层神丢失经元。 |
APP/PS-1转基因型 | 皮质和海马区有Aβ沉积、神经元的改变、神经行为学功能障碍。 | 外源性基因表达不稳定，造模费时、繁殖力差,费用高。 | |
转tau基因动物型 | 脑干和脊髓有NFT的形成、记忆障碍。 | 缺乏Aβ沉积 | |
外源性有害物质注入诱导 | Aβ注入诱导型 | Aβ沉积、免疫炎症反应、星形胶质细胞增生、tau蛋自过度磷酸化，ChAT活性显著下降。 | 不符合AD慢性起病的特点、Aβ聚集在注射位点局部，造模对脑组织造成非目的损伤。 |
铝中毒诱导型 | Aβ聚集、神经元变性、空间学习障碍和记忆损伤。 | 造模周期较长、中枢胆碱能活性未降低、NFT不同于AD患者。 | |
链脲菌素(STZ)型 | tau蛋白高度磷酸化、Aβ沉积、胆碱能的缺失、氧化应激。 | 动物死亡率较高、无神经纤维缠结和老年斑。 | |
东莨菪碱诱导型 | 方法简便易行、费用较低、胆碱能神经系统障碍、认知障碍。 | 缺乏AD典型病理特征 |
下面，小爱分享用Aβ 1-42诱导AD模型的方法[3]。
1、Aβ1-42的配制
(1) 取出储存于-80°C条件下的人工合成Aβ1-42冻干粉，室温下平衡30min；
(2) 在通风橱内，将 Aβ1-42悬浮于100%HFIP(1.596g/mL)中，浓度为1mM，充分混匀后分装成等量小份；
(3) 将分装的等量小份用真空离心蒸发浓缩器蒸发掉HFIP，蒸发后-20°C保存；
(4) 使用前，将上述-20°C保存的小份Aβ1-42重悬于DMSO中，浓度为5mM；
(5) 使用时，按实验需要用生理盐水或者人工脑脊液稀释至实验浓度。
2、小鼠单侧侧脑室埋管
(1) 小鼠吸入异氟烷麻醉后，固定于小鼠脑立体定位仪上；
(2) 用75%酒精对头部颅顶消毒，剃毛后再次消毒；
(3) 剪开头皮，暴露颅骨，双氧水去除颅骨表面的结缔组织。颅骨干燥后，再次消毒；
(4) 利用立体定位仪将定位针指向前囟门(Bregma)并作为起始点，移动定位针确定套管位置（前囟前0.46mm、颅骨中线左右各旁开1mm、深2.3mm），用颅骨钻钻孔，左右侧脑室随机放置套管（套管直径0.48mm、内芯直径0.3mm）；
(5) 用骨胶粘合套管与颅骨之间的缝隙，骨胶干燥后用牙科水泥将套管固定在颅骨上；
(6) 将小鼠转移至电热毯上，苏醒后放回饲养盒中，单笼单只饲养；
(7) 注射药物时，拔出导管内芯，用适宜长度PE管连接小鼠脑部套管和微量注射针，微量注射泵注射速度为0.5μL/min。
3、行为学任务
任务开始前对各组已完成套管埋置的小鼠注射生理盐水或者Aβ1-42，微量注射泵注射速度为0.5μL/min，注射2μL。注射完后停针5min防止注射液倒流，然后放回内芯，锁紧螺帽。自发转换Y迷宫实验和新异位置识别任务：小鼠注射药物10min后，开始自发转换Y迷宫实验和新异位置识别任务的检测。
AD验证方法
理想的模型应至少具备以下三个特征：
①具有AD的主要病理学特征：SP和NFP。
②出现AD的重要病理变化：神经元死亡、神经突触丢失和星形胶质细胞增生等。
③出现认知功能障碍。
在AD的基础研究和药物发现中，小鼠模型是揭示生物学机制、验证分子靶点和筛选潜在化合物的重要资源。转基因和非转基因小鼠模型都可以在体内获得不同类型的AD样病理。尽管有大量关于AD致病途径的遗传和生化研究，但作为一种以认知障碍为主要特征的疾病，任何干预措施的最终读数都应该是学习和记忆的检测[4]。
AD小鼠模型行为分析常用的测试实验包括：情境恐惧条件反射、放射臂水迷宫和Morris水迷宫(图2&3&4)。下面小爱以文献[4]为例，详细介绍情境恐惧条件反射实验设备及操作步骤。
小鼠在一个调理室中进行单独测试(图2)，该调理室位于一个带有透明有机玻璃窗口的音效衰减箱中，可以对实验进行视频记录。调整室有一个36bar的隔震格栅地板，地板是可拆卸的，在每个实验对象之后，用75%的乙醇清洗，然后再用水清洗。为了提供背景白噪声(72dB)，在音量衰减室的一侧安装了单个计算机风扇。
在行为实验之前，每天处理一次小鼠，连续3天。试验室里一次只放一只动物。将其放置在调理室中2min，然后以2800Hz和85dB的频率发出离散音调(CS)30s。在音调的最后2s内，鼠标通过地板条受到脚部电击（US，0.50-0.80mA，持续2s），可调节足部电击的强度来引发更强的记忆。在CS/US配对之后，将小鼠在调理室中再放置30s，然后将其放回笼子中。冻结行为可以通过使用专用软件进行评分。根据经验，通过手动评分冻结时间进行双重检查非常有用。训练24h后，将小鼠放回条件反应室。冻结时间为连续5min。在训练后36h将小鼠更换为条件箱。通过插入一个三角形笼子来创造一个新的环境，笼子的地板是光滑的，带有香草气味。2min后（CS前测试），将小鼠暴露在与训练中使用的音调特征相同的音调中3min（CS测试），并测定冻结时间。通常在每种情况下使用15-20只动物。
在测试恐惧记忆的过程中需要进行的一个重要控制是感觉阈值评估。对电击的感官知觉的改变可能是由于实验操作导致对观察到的表型记忆的错误归因。将一系列单脚电击传递给放置在恐惧条件所用相同电网上的动物。最初，0.1mA的电击持续1s，评估动物的退缩、跳跃和发声行为。每隔30s，冲击强度增加0.1-0.7mA，然后每隔30s以0.1mA的增量恢复到0mA。通过平均每只动物对足部电击表现出行为反应的电击强度，对每只动物的发声、退缩和跳跃阈值进行量化。
AD的治疗
据报道，目前全球阿尔茨海默病病例约为2400万例，2050年，痴呆症患者总数估计将增加4倍。尽管AD是一个公共卫生问题，但到目前为止，只有两类药物被批准用于治疗AD，包括胆碱酯酶抑制剂（天然衍生、合成和杂交类似物）和N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂[5]。
AD的几个生理过程会破坏乙酰胆碱生成细胞，减少胆碱能通过大脑的传递。乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEIs)分为可逆性、不可逆性和伪可逆性，通过阻断胆碱酯酶(AChE)和丁基胆碱酯酶(BChE)分解ACh，导致突触间隙中ACh水平增加而发挥作用。另一方面，NMDAR的过度激活导致内流的钙离子水平增加，从而促进细胞死亡和突触功能障碍。NMDAR拮抗剂阻止NMDAR谷氨酸受体的过度激活，从而阻止钙离子内流，并恢复其正常活动。尽管这两类药物有疗效，但它们只对治疗阿尔茨海默病的症状有效，但不能治愈或预防这种疾病。
图5 已被批准用于治疗AD的小分子药物化学结构式
建立理想的动物模型模拟人类疾病状态有利于开展AD病因、发病机制及防治的深入研究。目前由于无法建立很好的AD动物模型，所以在进行药物筛选时，同时用两种或两种以上AD动物模型比用单一模型更有说服力，同时也可进一步证实药物的有效性。
参考文献
[1] Puzzo D, Gulisano W, Palmeri A, et al. Rodent models for Alzheimer's disease drug discovery[J]. Expert opinion on drugdiscovery, 2015, 10(7):703-711.
[2] Breijyeh Z, Karaman R. Comprehensive Review on Alzheimer's Disease: Causes and Treatment [J]. Molecules, 2020, 25, (24).
[3] 吕君妍. Aβ1-42或Aβ1-15改善APP/PS1/Tau转基因阿尔茨海默症小鼠记忆的机制[D]. 华东师范大学, 2023.
[4] A D P, B L L, A A P,et al.Behavioral assays with mouse models of Alzheimer's disease: Practical considerations and guidelines-ScienceDirect[J]. Biochemical Pharmacology, 2014, 88( 4):450-467.
[5] Breijyeh Z, Karaman R,Comprehensive Review on Alzheimer's Disease: Causes and Treatment[J]. Molecules, 2020, 25:5789
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