Revvity 影像技术助力抗肿瘤药物研发

今年我们非常荣幸请到圣裘德儿童研究医院Dr.Jessica Wagner和福克斯詹士癌症中心的 Dr.Harvey Hensley为大家分享:使用分子影像技术在体内和体外水平揭示小分子药物 ONC201的抗肿瘤活性和免疫刺激作用。以下是报告的精彩内容：

ONC201背景介绍

在2013年以前，美国滨州州立大学(PennState University)和滨州赫尔歇医疗中心(Penn State Hershey MedicalCenter)的研究人员，通过筛选 NCI的免费分子库得到是一种高效的 抗癌分子，即ONC201 (又称TIC10或NSC350625)。

在2013年，Allen实验室发表的文章中显示，TIC10,也就是ONC201可以诱导肿瘤细胞 TRALL（重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体）的水平，对激酶AKT和MEK实施双重 抑制，导致转录因子FOXO3a去磷酸化，去磷酸化的FOXO3a发生从细胞质进入细胞核的 易位作用，在核内结合编码基因TRAIL的启动子上调其转录。同时在活体实验中显示出 单次剂量的有效性、令人欣喜的安全性和药代动力学。

Joshua E. Allen et al. Sci Transl Med 5, 171ra17 (2013);

在多个细胞系模型和包括结肠癌、乳腺癌和脑瘤等异种移植实体瘤模型中，发现ONC201 通过诱导TRAIL介导而引发的细胞凋亡促进肿瘤消退。此外，ONC201还表现出了较好的 药物特性，如稳定性好，口服生物利用度高和良好的血-脑屏障通透性。目前ONC201正 在各种恶性肿瘤中进行早期临床试验测试。

在2016年kline实验室发表的论文中，证实ONC201上调死亡受体DR5和ISR（整合应激 反应）进行肿瘤的杀伤。同时，ONC201通过双重阻碍Akt和ERK,从而释放Foxo3a进入 核并且激活TRAIL基因的转录，从而上调内源性TRAIL表达Dr.Jessica Wagner 实验室发现 ONC201通过类似于细胞效应引发的压力信号诱导eIF2-a-依 赖的活性转录因子ATF4和CHOP，增加DR5的表达，诱导细胞死亡。

研究正文

Dr.Jessica Wagner 在 2018年发表在 JCI杂志上的文章中，主要证实了以下三个结论。

1. 增加ONC201剂量和频率，疗效会随之增强（引导正在进行的临床试验更改ONC201的 剂量）;

2. ONC201 在活体水平可以抑制原位和转移的肿瘤，在体外水平也证实了可以抑制浸润和 迁移；

3. ONC201诱导NK细胞在肿瘤细胞中的累积和激活。

模型选择

为了证实以上结论，Dr.Jessica Wagner采用了几种动物模型，小鼠皮下肿瘤模型、原位接 种模型及肿瘤转移模型。在转移模型中发现，Vehicle 组的小鼠在肺部出现四个转移位点， 在ONC201治疗组并未发现转移位点。

小鼠肿瘤转移模型

1. 皮下/原位接种肿瘤细胞形成原位肿瘤： 小鼠形成微小的转移位点

2. 手术去除原位肿瘤 ：原位肿瘤直径大小在6-10mm时进行去除； 2-5 个月形成转移位点，时间取决于细胞系。

3. 尾静脉注射方式 ：最后一个模型是相对比较快速的，需要2-3周。尾静脉注射的方法也是经典的 方法，注射之后细胞会在肺部积累。虽然这个方法比较快速，但是不是优选的 模型。一般是在原位肿瘤未发现浸润的时候，才将肿瘤细胞接种在血液中。

检测方法

在这篇文章中，大量采用Revvity公司的影像系统来监测肿瘤的生长和转移，使用小 动物活体成像平台及多光谱成像系统监测生物发光信号和 GFP 的荧光信号。使用 IVIS系统进行生物发光成像，可以非常容易监测皮下和原位肿瘤的生长。

实验结果

1. 增加ONC201 剂量能够抑制肿瘤的生长和转移

ONC201 对肿瘤的生长和转移的抑制作用具有剂量依赖性。加入每3周一次的注射 频率在临床是耐受的，临床前实验提示证实，通过剂量增强可以增加ONC201的抗 肿瘤效果。文章发现，在结肠癌HCT116 p53–/–, HT29, 和乳腺癌MDA-MB-231模型 中，增加ONC201剂量，治疗增强。

同样Dr.Jessica Wagner2018年发表在JECCR的文章中，使用荧光成像观察HCT116 –GFP肿瘤，并 使用探针superhance 680 观察肿瘤血管影像，从肿瘤的影像可以看出，Vehicle处理组肿瘤内部具有 丰富的血流，ONC201处理组并没有大量的减少血管的量，而血管靶向药物Bevacizumab明显的减少 肿瘤血管的数量。这些结果提示我们可以将ONC201和抗血管类的药物联合使用进行肿瘤治疗。

生物发光检测转移位点

使用IVIS系统对解剖后肝脏及肺部的转移位点进行生物发光的成像，MDA-MB-231转移模 型中，可以看出ONC201治疗组的肿瘤明显小于对照组，并且发生率也低于对照组，甚至 25mg/kg4周注射一次，都能达到治疗效果。

荧光成像检测转移位点

手术去除原位肿瘤（HCT116GFP）,在转移性形成时给予治疗vehicle 或100 mg/kg ONC201，测量最后转移肿瘤的数量和大小。从图中可以看出转移位点出现在结肠和肝脏 的位置。ONC201治疗组可以明显减少肿瘤的转移。

Micro CT成像技术检测转移位点

进一步使用Revvity公司Quantum Micro CT系统检测ONC201在小鼠转移模型中的抗转移的 效果。使用HT29尾静脉注射模型，经过ONC201或Vehicle治疗后，可以看到ONC201 可以 减小肺部转移位点的体积，而Vehicle处理组肿瘤在持续生长。

组织定量病理成像

使用Vectra全自动定量病理系统结合Inform软件对IHC组织进行成像和分析，检测微弱表达 的生物标志物。Inform软件具有自学习功能，通过训练可以快速的区分肿瘤实质、间质及 其他区域，并且进行定量。我们选用MDA-MB-231细胞系及MDA-MB-231shTRAIL细胞， 接种在小鼠体内。Vehicle 或ONC201治疗四周后，每个肿瘤组织取两张切片使用Vectra系 统进行扫描，整张切片使用Inform进行分析。有趣的是，在野生型肿瘤模型中，Vehicle 或 ONC201治疗组cleaved caspase-3表达有轻微的区别，而Ki-67+ 细胞的数量相差很大。 shTRAIL tumors模型中并没有明显的变化。这些结果说明ONC201对肿瘤转移的抑制作用 至少部分是TRAIL-依赖途径下调肿瘤细胞的迁移和入侵的方法实现的。

参考文献：

1. Jessica Wagner et al., Dose intensification of TRAIL-inducing ONC201 inhibits metastasis and promotes intratumoral NK cell recruitment J Clin Invest. 2018;128(6):2325-2338.

2. Jessica Wagner et al. Anti-tumor effects of ONC201 in combination with VEGF-inhibitors significantly impacts colorectal cancer growth and survival in vivo through complementary non overlapping mechanisms Journal of Experimental & Clinical Cancer Research (2018) 37:11.

3. Allen JE, et al. Dual inactivation of Akt and ERK by TIC10 signals Foxo3a nuclear translocation,TRAIL gene induction, and potent antitumor effects. Sci Transl Med. 2013;5(171):171ra17.