逆转录-聚合酶链反应 （Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR） 的原理是：提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的 mRNA 作为模板，采用 Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
实验步骤：
一、总 RNA 的提取
按照总 RNA 提取实验步骤提取组织或细胞中的总 RNA。
二、cDNA 第一链的合成
目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以 GIBICOL 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
1、在 0.5 ml 微量离心管中，加入总 RNA 1～5 μg，补充适量的 DEPC H2O 使总体积达 11 μl。在管中加 10 μM Oligo（dT）12～18 1 μl，轻轻混匀、离心；
2、70℃ 加热 10 min，立即将微量离心管插入冰浴中至少 1 min；
3、取 0.5 ml PCR 管，依次加入下列试剂：第一链 cDNA 2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP（2 mM） 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl。轻轻混匀，离心。42℃ 孵育 2～5 min；
4、加入 SuperscriptⅡ1 μl ,在 42℃ 水浴中孵育 50 min；
5、于 70℃ 加热 15 min 以终止反应；
6、将管插入冰中，加入 RNase H 1 μl，37 ℃ 孵育 20 min，降解残留的 RNA。-20 ℃ 保存备用。
三、PCR
1、取 0.5 ml PCR 管，依次加入下列试剂：第一链 cDNA 2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP（2 mM） 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl；
2、加入适量的 ddH2O，使总体积达 50 μl。轻轻混匀，离心；
3、设定 PCR 程序。在适当的温度参数下扩增 28～32 个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在 PCR 扩增目的基因时，加入一对内参（如 G3PD）的特异性引物，同时扩增内参 DNA，作为对照；
4、电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；
5、密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
注意事项：
1、在实验过程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA 的完整性。在总 RNA 的提取过程中，注意避免 mRNA 的断裂；
2、为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照；
3、内参的设定：主要为了用于靶 RNA 的定量。常用的内参有 G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。
4、其目的在于避免 RNA 定量误差、加样误差以及各 PCR 反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差；
5、PCR 不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标 DNA 起始的数量有关。
6、故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定；
7、防止 DNA 的污染： 采用 DNA 酶处理 RNA；在可能的情况下，将 PCR 引物置于基因的不同外显子，以消除基因和 mRNA 的共线性。
