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2024/5/29 10:48:23支原体(Mycoplasma):目前发现的最小原核生物,据统计约15~35% 的细胞被支原体污染。支原体污染会改变宿主细胞的结构与功能,易致实验结果不稳定,须对培养细胞定期进行支原体检测。
本试剂盒采用双色荧光 qPCR (TaqMan 探针法) 检测支原体DNA。检测对象为细胞培养的上清液,细胞沉淀或其他生物制品。该试剂盒具有以下特点:
灵敏:配合推荐使用的核酸抽提方案,检测灵敏度达到10CFU/ml。
可靠:抽提加入内标核酸,全过程质量控制。
稳定:全程闭管操作,无交叉污染。
方便:操作简单,无需电泳步骤。
表1 产品组分
注:
1、阳性质控含有支原体DNA和内标DNA。
2、内部质控含有内标DNA。
在实验前请完整阅读本说明书,务必重视注意事项和无菌操作规范!
(1)样本的标准制备方案:请配合使用高效无微生物污染的DNA抽提试剂盒提取样本DNA。整个过程需要遵守无菌操作规范。本公司目前推荐抽提试剂盒见附录3。直接取20 µL待测样本DNA,作为模板进行 qPCR 反应。
(2)前处理阴性样本准备方案:将RNase Free Water当成样本,加入内部质控,进行核酸抽提。
2. qPCR 反应液的准备
(1)根据所要检测样品的数量,计算所需反应孔数,每个样本做3个重复孔。
反应孔数=1个阳性PCR质控+1个阴性PCR质控+1个前处理阴性质控+样本数× 3
(2)根据反应孔数计算所需的qPCR Mix 总量(需有1孔的加样损失量):
Mix =(反应孔数+1)×10 μl
(3)各试剂放室温融化,并根据下表所示准备 qPCR Mix:
表2 qPCR Mix的配制
(1)震荡混匀 qPCR Mix,低速离心,将管盖残留液体收集至管底。
(2)向每孔反应管中分装 10 μL qPCR Mix。
(3)向已分装过 qPCR Mix 的反应管中加入15 ul石蜡油。
(4)向反应管中加入样品后短暂离心,加样示例如下:
表 3 加样示例
【注】:此时每个反应孔的体积为30μL。
qPCR 阴性的PCR模板为20 ul RNase Free Water。
PCR 仪设置以 ABI 7500 为例,相对定量模式,选择TaqMan 探针法:
注:1、该程序为两阶段扩增法,如荧光定量PCR仪可以两阶段收集荧光,按照正常Ct值判断结果;如果只能最后一步收集荧光,需要在原数据的基础上加15个Ct值。
2、ROX设置是以7500为例,但也存在例外,例如StepOne。
【阈值设置】
以ABI 7500 为例,扩增曲线选择 log 法,如果不能两阶段收集荧光,基线设置1~2个循环;如果可以,基线设置3-15个循环。建议用 log 法扩增曲线保证结果稳定可靠。
(1) 内参(HEX/VIC)阈值设定:以阳性对照定内参扩增曲线阈值,将内参的Ct 值定为 28±2。
(2)支原体(FAM)阈值设定:以阳性对照定支原体扩增曲线阈值,将支原体(FAM)的 Ct 值定为 28±2 。
【实验质量控制】
如果阳性对照管的支原体(FAM)Ct 值>30,但阳性对照管及前处理阴性对照管的内参(HEX)Ct 值正常,表明阳性支原体对照模板有降解。
如果样品前处理阴性的内参(HEX/VIC)Ct 值>30,阳性对照管的内参(HEX)Ct 值>30 ,表明内参DNA存在降解或PCR体系扩增效率下降。
根据支原体(FAM) Ct 值、内标(VIC) Ct 值判定,具体标准如下:
要求每个检测样品做3重复,如果3复孔中,两重复为阳性,则判读为阳性;建议做样本前处理阴性,可以质控整个抽提过程。
注:检测结果异常时:
1. 样品前处理阴性:内参Ct值过大,表明抽提效率低;支原体检测通道Ct值小于37.5,可能前处理抽提过程存在污染。
2. qPCR阴性:支原体和内参检测通道Ct值小于37.5,操作过程存在污染。
3. 样本前处理阴性质控和PCR阳性质控内参差1±1个Ct值属于正常现象。
由于 PCR 反应非常灵敏,实验操作中应注意以下事项,以免发生DNA 污染:
1.试剂盒开启后,阳性质控和内部质控与试剂Biowing® MyqPCR Reaction Mix1、Biowing®MyPrimer&Probe Mix2、RNase Free Water、石蜡油分开存放。
2.每个组分在使用前都应先低速离心后小心开启。使用时请上下轻柔颠倒十次混匀,避免起泡,并低速短暂离心后使用。
3.要求核酸抽提和qPCR过程都符合无菌操作规范。
4.建议自备转运盒,用于将配制分装好的Mix从配置Mix超净工作台转运到加样超净工作台。
5.建议在 qPCR 反应板上阳性对照的排布应远离待测样本和阴性对照。
6.建议 qPCR 配置与分装在一个无菌操作台,样本的加样在另外一个无菌操作台。
7.建议使用不同的移液器添加阳性对照与待测样本、阴性对照,并使用带滤芯的枪头进行加样。
8.应按照先加阴性,再加样本,最后加阳性的顺序加样。且阳性用专门的加样器。建议阳性在专门的无菌操作台加样。
9.qPCR 反应板封膜或盖盖子时须反复压紧。
10.上机扩增前,反应管短时低速离心,将管壁液体收集至管底
11.盖上反应管盖子或者贴上光学膜后,为避免影响荧光信号读取,请注意不要在管盖或者膜上做标记,或者用刮板反复摩擦。
12.本产品仅作科研用途。