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高灵敏度支原体检测

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2024/5/29 10:48:23

支原体(Mycoplasma):目前发现的最小原核生物,据统计约15~35% 的细胞被支原体污染。支原体污染会改变宿主细胞的结构与功能,易致实验结果不稳定,须对培养细胞定期进行支原体检测。

本试剂盒采用双色荧光 qPCR (TaqMan 探针法) 检测支原体DNA。检测对象为细胞培养的上清液,细胞沉淀或其他生物制品。该试剂盒具有以下特点:

灵敏:配合推荐使用的核酸抽提方案,检测灵敏度达到10CFU/ml。

       可靠:抽提加入内标核酸,全过程质量控制。

       稳定:全程闭管操作,无交叉污染。

       方便:操作简单,无需电泳步骤。

表1   产品组分

注:

1、阳性质控含有支原体DNA和内标DNA。

2、内部质控含有内标DNA。

在实验前请完整阅读本说明书,务必重视注意事项和无菌操作规范!

【操作步骤】

1.样本制备

    (1)样本的标准制备方案:请配合使用高效无微生物污染的DNA抽提试剂盒提取样本DNA。整个过程需要遵守无菌操作规范。本公司目前推荐抽提试剂盒见附录3。直接取20 µL待测样本DNA,作为模板进行 qPCR 反应。

     (2)前处理阴性样本准备方案:将RNase Free Water当成样本,加入内部质控,进行核酸抽提。

2. qPCR 反应液的准备

       (1)根据所要检测样品的数量,计算所需反应孔数,每个样本做3个重复孔。

     反应孔数=1个阳性PCR质控+1个阴性PCR质控+1个前处理阴性质控+样本数× 3

      (2)根据反应孔数计算所需的qPCR Mix 总量(需有1孔的加样损失量):

     Mix =(反应孔数+1)×10 μl

      (3)各试剂放室温融化,并根据下表所示准备 qPCR Mix:


表2  qPCR Mix的配制

3. 加样

      (1)震荡混匀 qPCR Mix,低速离心,将管盖残留液体收集至管底。

      (2)向每孔反应管中分装 10 μL qPCR Mix。

      (3)向已分装过 qPCR Mix 的反应管中加入15 ul石蜡油。

      (4)向反应管中加入样品后短暂离心,加样示例如下:

      表 3 加样示例


【注】:此时每个反应孔的体积为30μL。

       qPCR 阴性的PCR模板为20 ul RNase Free Water。

PCR 仪设置以 ABI 7500 为例,相对定量模式,选择TaqMan 探针法:

注:1、该程序为两阶段扩增法,如荧光定量PCR仪可以两阶段收集荧光,按照正常Ct值判断结果;如果只能最后一步收集荧光,需要在原数据的基础上加15个Ct值。

   2、ROX设置是以7500为例,但也存在例外,例如StepOne。


【阈值设置】

  以ABI 7500 为例,扩增曲线选择 log 法,如果不能两阶段收集荧光,基线设置1~2个循环;如果可以,基线设置3-15个循环。建议用 log 法扩增曲线保证结果稳定可靠。

(1) 内参(HEX/VIC)阈值设定:以阳性对照定内参扩增曲线阈值,将内参的Ct 值定为 28±2。

 (2)支原体(FAM)阈值设定:以阳性对照定支原体扩增曲线阈值,将支原体(FAM) Ct 值定为 28±2 。


实验质量控制

如果阳性对照管的支原体(FAM)Ct 值>30,但阳性对照管及前处理阴性对照管的内参(HEX)Ct 值正常,表明阳性支原体对照模板有降解。

如果样品前处理阴性的内参(HEX/VIC)Ct 值>30,阳性对照管的内参(HEX)Ct 值>30 ,表明内参DNA存在降解或PCR体系扩增效率下降。


   【结果判读】

根据支原体(FAM) Ct 值、内标(VIC) Ct 值判定,具体标准如下:



要求每个检测样品做3重复,如果3复孔中,两重复为阳性,则判读为阳性;建议做样本前处理阴性,可以质控整个抽提过程。

注:检测结果异常时:

1. 样品前处理阴性:内参Ct值过大,表明抽提效率低;支原体检测通道Ct值小于37.5,可能前处理抽提过程存在污染。

2. qPCR阴性:支原体和内参检测通道Ct值小于37.5,操作过程存在污染。

3. 样本前处理阴性质控和PCR阳性质控内参差1±1个Ct值属于正常现象。

  【PCR过程注意事项】

由于 PCR 反应非常灵敏,实验操作中应注意以下事项,以免发生DNA 污染:

  1.试剂盒开启后,阳性质控和内部质控与试剂Biowing® MyqPCR Reaction Mix1、Biowing®MyPrimer&Probe Mix2、RNase Free Water、石蜡油分开存放。

   2.每个组分在使用前都应先低速离心后小心开启。使用时请上下轻柔颠倒十次混匀,避免起泡,并低速短暂离心后使用。

  3.要求核酸抽提和qPCR过程都符合无菌操作规范。

  4.建议自备转运盒,用于将配制分装好的Mix从配置Mix超净工作台转运到加样超净工作台。

  5.建议在 qPCR 反应板上阳性对照的排布应远离待测样本和阴性对照。

  6.建议 qPCR 配置与分装在一个无菌操作台,样本的加样在另外一个无菌操作台。

  7.建议使用不同的移液器添加阳性对照与待测样本、阴性对照,并使用带滤芯的枪头进行加样。

  8.应按照先加阴性,再加样本,最后加阳性的顺序加样。且阳性用专门的加样器。建议阳性在专门的无菌操作台加样。

  9.qPCR 反应板封膜或盖盖子时须反复压紧。

 10.上机扩增前,反应管短时低速离心,将管壁液体收集至管底

 11.盖上反应管盖子或者贴上光学膜后,为避免影响荧光信号读取,请注意不要在管盖或者膜上做标记,或者用刮板反复摩擦。

 12.本产品仅作科研用途。




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