中华人民共和国水产行业标准
SC/T 3018-2004
水产品中氯霉素残留量的测定 气相色谱法
Determination of chloramphenicol residues in fishery products
Gas chromatography
前言
本标准由中华人民共和国农业部提出。
本标准起草单位：国家水产品质量监督检验中心。
本标准主要起草人：冷凯良、李兆新、李晓川、王联珠、翟毓秀、陈远惠。
1范围
本标准规定了水产品中氯霉素残留量的气相色谱测定方法。
本标准适用于水产品可食部分中氯霉素残留量的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
样品经乙酸乙酯提取并浓缩，提取物溶于水，用正己烷脱脂， C18固相萃取柱净化，硅烧化试剂衍生化后，用配有电子捕获检测器的气相色谱仪测定，外标法定量。
4试剂
所有试剂在氯霉素出峰处应无干扰峰，最好选择优级纯或色谱纯试剂。
4.1氯霉素标准品：纯度≥99%。
4.2甲醇：色谱纯。
4.3乙酸乙酯：色谱纯。
4.4 正己烷：优级纯。
4.5氯仿：分析纯。
4.6 乙腈：色谱纯。
4.7无水硫酸钠：分析纯，650℃灼烧4 h，冷却后贮于密闭容器中备用。
4.8氯化钠：分析纯。
4.9 4%氯化钠溶液：称取氯化钠20g，加水溶解，稀释到500mL。
4.10氯霉素标准溶液：准确称取氣霉素标准品0.0250g，用甲醇溶解并定容至50mL，配成浓度为500μg/mL的标准贮备液，置4℃冰箱中保存，保存期不超过3个月。临用前，取此贮备液，用甲醇稀释成浓度为0.100 μg/mL的标准工作液。
注：通常的玻璃器皿洗涤程序对于从坡璃表面除去痕量氯霉素不总是很有效的，建议使用甲醇淋洗所有玻璃器皿，以避免污染问题。
4.11衔生化试剂：N,O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）/三甲基氯硅烷（TMCS）体积比99：1。
4.12 水：实验用水应符合GB/T 6682中一级水标准。
5仪器
实验室常规仪器、设备及下列各项。
5.1气相色谱仪：配63Ni 电子捕获检测器。
5.2 电子天平：感量0.0001g。
5.3 均质机。
5.4 离心机。
5.5旋涡混合器。
5.6电热恒温水浴锅。
5.7旋转蒸发器。
5.8鸡心瓶：50 mL、100 mL，细口。
5.9 玻璃离心管：50 mL。
5.10刻度离心管：5 mL，具塞。
5.11 氮吹仪。
5.12 C18固相萃取柱，填料300 mg。
5.13 SPE固相萃取装置。
5.14无水硫酸钠柱：砂芯玻璃层析柱中装无水硫酸钠5g。
6色谱条件
6.1 色谱柱：DB-5石英毛细管柱，固定相：SE-54（聚甲基苯基乙烯基硅氧烷），30 m×0.53 mm×0.5μm；或与之相当的色谱柱。
6.2 载气：氮气，线速度29 cm/s。
6.3 进样口温度：260℃。
6.4温度程序：初始柱温150℃，维持1min，15℃/min升至260℃，维持10min或直到氯霉素已经流出，然后设定30℃/min升至280℃，维持5min，以确保所有的样品已经流出。
6.5 检测器温度：300℃。
6.6进样方式及进样量 ：无分流方式进样，1 μL。
6.7检测器：63Ni电子捕获检测器。
7测定步骤
7.1 样品预处理
鱼去鳞、皮，沿背脊取肌肉；虾去头、壳、附肢，取可食肌肉部分；蟹、中华鳖等取可食肌肉部分；样品切为不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块后混匀，放置冰箱中冷冻贮存备用。
7.2 提取
将样品解冻.称取样品5g（精确到0.001g）.置于50mL玻璃离心管中，加入乙酸乙酯20mL，均质机均质1min，分散均匀，提取氯霉素，4000r/min离心3min，将乙酸乙酯层转移到100mL细口鸡心瓶中。再向离心管中加乙酸乙酯10 mL，用原均质机均质混合1 min，4 000 r/min离心3 min，合并乙酸乙酯提取液于100 mL细口鸡心瓶中，于40℃水浴中减压旋转蒸发至干。
注：均质机清洗方法.先用大量水浸洗，再用甲醇浸洗，最后用蒸馏水浸洗。
7.3 脱脂净化
向鸡心瓶中加1 mL甲醇旋涡混合溶解残留物，再加入15 mL正己烷和25 mL 4%氯化钠溶液，盖塞振荡混合1min，充分混合提取脂肪，转移到另一50mL离心管中，4000r/min的速度离心2min，除去上层正己烷相并弃去。再向水相中加10 mL正己烷，重复提取一遍，弃去正己烷相。
水相中加入15 mL乙酸乙酯，旋涡混合器混合2 min，3 000 r/min离心3 min，吸取乙酸乙酯层，经过无水硫酸钠柱脱水过滤于50 mL鸡心瓶中。再向水相中加入5 mL乙酸乙酯，重复上述操作。用少量乙酸乙酯淋洗无水硫酸钠柱，合并提取液于50 mL鸡心瓶中，在40℃水浴中减压旋转蒸发至干。对于大部分样品，到此步骤净化效果已可达到要求，对于净化不完全的样品可经C18固相萃取柱进一步净化。
加入2 mL乙酸乙酯溶解提取物并转移于5 mL具塞离心管中，用1 mL乙酸乙酯洗涤鸡心瓶，合并乙酸乙酯，于50℃~ 55℃的砂浴中吹氮蒸发至近干，再用1 mL乙酸乙酯洗涤离心管壁并吹干。注意防潮。
7.4 C18柱净化
注意：以下步骤必须连续做完，切莫让吸附剂变干。
给每个样品准备-根C18柱，顺序用5mL甲醇、5mL氯仿、5mL甲醇和5mL水淋洗活化C18柱，弃掉洗涤液。用5mL体积分数为5%的乙腈水溶液溶解7.3中在40℃水浴中减压旋转蒸发至干的提取物，吸取水溶液装入C18柱过柱，弃掉流出液。注意流速保持每秒一滴，否则净化效果和回收率都较差。用1 mL水淋洗鸡心瓶2遍，并将淋洗液加入C18柱过柱，弃掉流出液。用5 mL水淋洗C18柱，让洗涤液完全流出C18柱，用微氮吹干。用乙腈将C18柱中的氯霉素洗脱，洗脱2次，每次1.5 mL，合并洗脱液于5mL具塞离心管中。在温度50℃~55℃的砂浴中，用氮气吹除乙腈至近干，再用1mL乙腈洗涤离心管壁并用氮气吹干。注意防潮。
7.5 衍生化
7.5.1试样的衍生化
向干的残留物中加100 μL術生化试剂，盖塞并旋涡混合10s，在70℃烘箱中反应30 min。再在50℃~55℃砂浴中，用氮气流吹除多余的试剂，至样品管刚好吹干为止（注意：此步过长的吹干时间可导致丢失分析物）。加入0.5 mL正己烷，旋涡混合10s， 供气相色谱分析用。
7.5.2标准工作液的衍生化
取适量标准工作液于5 mL具塞离心管中，在温度50℃~ 55℃的砂浴中，用氮气吹除溶剂至干。以下按7.5.1的步骤操作。
7.6 样品测定
分别注入1 μL适当浓度的氯霉素标准硅烷化衍生物溶液及样品提取物硅烷化行生物溶液于气相色谱仪中，按上述色谱条件进行色谱分析，记录峰面积，响应值均应在仪器检测的线性范围之内。根据标准样品的保留时间定性，外标法定量。
7.7计算
样品中氯霉素的含量按公式（1）计算。
式中：
X——样品中氯霉素含 量，单位为微克每千克（μg/kg）；
Cs——标准衍生物溶液 相当氯霉素含量，单位为纳克每毫升（ng/mL） ；
A——试样液中氯霉索衍生物的峰面积或峰高，单位为微伏秒或毫米（μV.s或mm）；
V——-样品提取物衍生化溶液体积，单位为毫升（mL）；
As——氯霉素标准衍生物的峰面积或峰高，单位为微伏秒或毫米（μV.s或mm）；
m——样品质量，单位为克（g）。
注：计算结果需扣除空白值。
8方法回收率
标准添加浓度为0.1μg/kg~ 20.0μg/kg时，回收率≥70%。
9方法检测限
本方法检测限：0.3 μg/kg。
10允许差
两次平行测定结果相对偏差≤15%。
11 方法的线性范围
本方法的线性范围：标准衍生物溶液相当氯霉素浓度为0.5 ng/mL~ 250 ng/mL。
