技术文章

概述

肿瘤微环境(tumor microenvironment, tme)是由肿瘤相关基质细胞、免疫细胞，以及相应细胞的分泌产物（如细胞因子和趋化因子）和细胞外基质(ecm)中的非细胞成分组成的。肿瘤微环境为肿瘤提供了良好的生长环境和营养物质，促进肿瘤的进展和转移，这也是临床中导致许多个体患者常规治疗失败的原因。肿瘤类器官相对于pdx动物模型，体外培养环境相对单纯，而缺乏肿瘤微环境的类器官模型，又很难wan全模拟肿瘤对于药物的反应性，特别是免疫细胞随着肿瘤类器官的培养，会逐渐功能下降、数量减少，甚至于逐渐消失。

目前类器官的培养方法是机械破碎法，使用弹力剪将肿瘤组织剪成1mm³的碎片，加入培养液，在水平摇床上震荡培养。研究结果证明，随着类器官的培养肿瘤免疫细胞会大量的损失，肿瘤免疫微环境受到了很大的破坏。有文献报道采用气液交互法(air-liquid interface, ali)培养组织来源的类器官，可以在一定程度上保留组织原位的免疫微环境。今天，给大家介绍采用ALI方法培养类器官的方法。

培养方法

原代

一、准备工作

1、仪器设备

CO₂培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅(abs72023)或水浴摇床，医用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科镊。

2、试剂耗材（以肺癌为例）

人肺癌类器官培养试剂盒(abs9443)、基质胶（低因子、无酚红）(abs9495)、60mm细胞培养皿(abs7005)、100μm滤筛(abs7009)、15mL离心管（尖底，无菌无酶）(abs7120)、1.5mL EP管若干(abs7119)、细胞小室（PET膜，6.5mm，孔径0.4um，含24孔板）(abs7280)、金属冰盒(abs7289)、眼科剪刀、眼科镊。

人肺癌类器官培养试剂盒(abs9443)

基质胶（低因子，无酚红）(abs9495)

二、操作步骤

 1、细胞小室底层凝胶基质的制备

（1）基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化；

（2）枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时；

（3）融化后的基质胶可一直放4℃储存，建议2周内用完。

低温金属冰盒(abs7289)

（4）在细胞培养超级净台中，用100uL枪头吸取50uL基质胶加入细胞小室（注意铺展均匀），将小室放入24孔板，将孔板放入培养箱，静置40-60min直到基质胶凝固为止。

2、样本准备

（1）将组织放入含有预冷的（2-8°C）组织保存液E的取样瓶中（浸没整个组织），4℃从医院/实验室取回；

（2）将取样瓶消毒，组织取出放入培养皿样本拍照，并登记，大小，颜色，软硬程度，组织类型等信息。

3、清洗-剪碎

在60mm细胞培养皿(abs7005)里用2-3mL原代培养缓冲液B浸泡。用原代培养缓冲液B清洗三次（每次更换培养皿）后剪碎，剪成大约1-3mm³的组织块，转移至15mL离心管。

4、消化-过滤

（1）向15mL离心管中加入5倍原代组织消化液C（消化液体积：组织体积=5:1，如果估量组织体积困难，使用5mL消化液通常足够）在4℃进行消化15-30min（消化过程中随时观察消化情况）。

（2）取少量液体在显微镜下观察，镜下观察到较多的细胞团（5-50个细胞抱团）后， 加入3倍体积原代培养缓冲液B （缓冲液体积：消化液体积=3:1）终止消化，用枪头轻柔吹打可以看到液体变浑浊。

（3）使用100μm滤筛(abs7009)进行过滤，取少量滤液在镜下进行观察。将滤液收集到15mL离心管，于300g 4℃ 富集离心5min后移去上清。

5、加胶-点板-加液（这里是整个原代操作的点睛之笔）

（1）准备工作

a. 基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化；

b. 枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时；

c. 融化后的基质胶可一直放4℃储存，建议2周内用完。

（2）接种要求

细胞小室（PET膜，6.5mm，孔径0.4um，含24孔板）(abs7280)，每个细胞小室孔加入50uL基质胶细胞团混合物。

（3）接种密度

密度建议1：基质胶体积：细胞团沉淀体积=25:1（如果估摸细胞团沉淀体积困难，通常加300uL基质胶足够）

密度建议2：1000个细胞团/50uL基质胶（如果想计数接种，可以参照此密度建议）

（4）加胶-点板

向细胞团沉淀加入基质胶(abs9495)，进行吹打混匀（不要满吹满打，容易产生气泡），向每个铺了基质凝胶的小室内加入50uL细胞团基质胶混悬物，（整个操作在金属冰盒或冰上进行，操作熟练以后，加胶，混匀，点板控制在半分钟内，有利于保持基质胶良好的流畅性）。将铺好的培养板放入37℃培养箱中40-60min成胶。

（5）加液

含组织的上层凝胶凝固以后，将24孔板放入超净台，向下培养孔加入适量类器官培养基，培养基的水平面不得超过上面的细胞凝胶层（如下图），这样就可以形成ALI微环境。

（6）将培养板放于培养箱，每2天换一次液，大概10-14天，多数类器官直径在100um以上，可进行传代操作。

传代（消化分两种情况）

一、细胞小室底层凝胶基质的制备

1、基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化；

2、枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时；

3、融化后的基质胶可一直放4℃储存，建议2周内用完；

4、在细胞培养超级净台中，用100uL枪头吸取50uL基质胶加入细胞小室（注意铺展均匀），将小室放入24孔板，将孔板放入培养箱，静置40-60min直到基质胶凝固为止。

二、类器官数量较多或体积较大传代步骤

1、类器官收集及洗涤

（1）收集：用移液器吸去外培养孔的培养基，向每个细胞小室添加1mL左右4℃类器官传代培养缓冲液G，轻柔吹散基质胶和类器官，收集在15mL离心管中（24孔板，每5个细胞小室孔为一组）。

（2）洗涤：加类器官传代培养缓冲液G定容至14mL（缓冲液越多，基质胶被稀释的越充分，越容易去除），4℃静置40min或-20℃放置5min（目的是使基质胶软化，如果冰箱保温效果强，缩短冷冻时间，摸索合适的冷冻时间时，可取出离心管摇晃看不到基质胶说明冷化好了）。

（3）接下来将离心管进行300g，4℃，离心5min，离心完通常会有这两种情况：

第一种是正常情况，分成三层（如下图），此时弃掉上清和基质胶层，保留类器官沉淀即可。

第二种是不正常情况，分成两层（如下图），这种情况可能与冷化不充分有关。此时弃掉缓冲液，留下基质胶类器官混悬液，重复上一步洗涤步骤，再次冷化离心，通常能出现清晰分层（缓冲液层、基质胶层、类器官沉淀层），此时弃掉上清和基质胶层，保留类器官沉淀即可。如果依然是两层（缓冲液层和基质胶类器官混悬液层），此时弃掉缓冲液和上1/3的基质胶类器官混悬液，保留下2/3即可。

促进基质胶和类器官有效分离条件：

a. 离心机的选择非常重要，水平角离心机相比固定角离心机更利于基质胶和类器官分离；

b. 离心机的温度最好是4℃（可避免基质胶固化），离心转速可适当提高（最高不要超过500g），离心时间可适当加长（最常不超过10min）。

2、类器官消化

（1）添加2-3mL类器官传代消化液D于超净台内消化2-3min，消化期间吹打1-2次。此步骤以消化成细胞团为主，千万不要消化成单细胞，单细胞类器官存活率低。如果不确定是否消化适宜，可吸取数微升镜下观察，如果有较多细胞团可停止消化。

（2）添加5倍类器官传代培养缓冲液G（缓冲液：消化液=5:1）终止消化，300g 4℃离心5min弃去上清（如果有基质胶残留，残留量<50uL正常，不影响传代类器官增殖）

3、加胶-点板-加液

（1）准备工作

a. 基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化；

b. 枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时；

c. 融化后的基质胶可一直放4℃储存，建议2周内用完。

（2）接种要求

细胞小室（PET膜，6.5mm，孔径0.4um，含24孔板）(abs7280)，每个细胞小室孔加入50uL基质胶细胞团混合物。

（3）接种密度

密度建议1： 类器官通常按1:2传代，例如，细胞小室收集5孔，传代10孔，需要的基质胶量50*10=500uL；

密度建议2：1000个细胞团/50uL基质胶（如果想计数接种，可以参照此密度建议）；

注意：不管是按密度建议1还是，密度建议2，如果有残留的基质胶，新胶量至少是残留胶量的1.5倍。

（4）加胶-点板

向细胞团沉淀加入基质胶(abs9495)，进行吹打混匀（不要满吹满打，容易产生气泡），向每个铺了基质凝胶的小室内加入50uL细胞团基质胶混悬物，（整个操作在金属冰盒或冰上进行，操作熟练以后，加胶，混匀，点板控制在半分钟内，有利于保持基质胶良好的流畅性）。将铺好的培养板放入37℃培养箱中40-60min成胶。

（5）加液

含组织的上层凝胶凝固以后，将24孔板放入超净台，向下培养孔加入适量类器官培养基，培养基的水平面不得超过上面的细胞凝胶层，这样就可以形成ALI微环境。

（6）将培养板放于培养箱，每2天换一次液，大概7-10天，多数类器官直径在100um以上，可进行传代操作。

三、类器官数量不足或体积较小时：

1、类器官收集、吹打、洗涤

（1）收集：用移液器吸去下培养孔的培养基，向每个细胞小室添加1mL左右4℃类器官传代培养缓冲液G，轻柔吹散基质胶和类器官，转移到下培养孔。

（2）进行吹打，将类器官吹成细胞团（可取样镜下观察有较多细胞团时可停止吹打）；

（3）洗涤：24孔板，每5孔为一组，收集在15mL离心管中，加类器官传代培养缓冲液G定容至14mL（缓冲液越多，基质胶被稀释的越充分，越容易去除），4℃静置40min或-20℃放置5min（目的是使基质胶软化，如果冰箱保温效果强，缩短冷冻时间，摸索合适的冷冻时间时，可取出离心管摇晃看不到基质胶说明冷化好了）。

（4）接下来将离心管进行300g，4℃，离心5min，离心完通常会有这两种情况：

第一种是正常情况，分成三层（如下图），此时弃掉上清和基质胶层，保留细胞团沉淀即可。

第二种是不正常情况，分成两层（如下图），这种情况可能与冷化不充分有关。此时弃掉缓冲液，留下基质胶类器官混悬液，重复上一步洗涤步骤，再次冷化离心，通常能出现清晰分层（缓冲液层、基质胶层、类器官沉淀层），此时弃掉上清和基质胶层，保留类器官沉淀即可。如果依然是两层（缓冲液层和基质胶细胞团混悬液层），此时弃掉缓冲液和上1/3的基质胶细胞团混悬液，保留下2/3即可。

促进基质胶和类器官有效分离条件：

a. 离心机的选择非常重要，水平角离心机相比固定角离心机更利于基质胶和类器官分离；

b. 离心机的温度最好是4℃（可避免基质胶固化），离心转速可适当提高（最高不要超过500g），离心时间可适当加长（最常不超过10min）。

2、加胶-点板-加液

（1）准备工作

a. 基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化；

b. 枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时；

c. 融化后的基质胶可一直放4℃储存，建议2周内用完。

（2）接种要求

细胞小室（PET膜，6.5mm，孔径0.4um，含24孔板）(abs7280)，每个细胞小室孔加入50uL基质胶细胞团混合物。

（3）接种密度

密度建议1： 对于类器官数量较少的情况，为了维持生长所需的旁分泌信号，需要2-3孔富集到1孔，例如，24孔板收集6孔，2孔富集1孔，铺3孔，需要的基质胶量50*3=150uL。

密度建议2：1000个细胞团/50uL基质胶（如果想计数接种，可以参照此密度建议）

注意：不管是按密度建议1还是按密度建议2，如果有残留的基质胶，新胶量至少是残留胶量的1.5倍

（4）加胶-点板

向细胞团沉淀加入基质胶(abs9495)，进行吹打混匀（不要满吹满打，容易产生气泡），向每个铺了基质凝胶的小室内加入50uL细胞团基质胶混悬物，（整个操作在金属冰盒或冰上进行，操作熟练以后，加胶，混匀，点板控制在半分钟内，有利于保持基质胶良好的流畅性）。将铺好的培养板放入37℃培养箱中40-60min成胶。

（5）加液

含组织的上层凝胶凝固以后，将24孔板放入超净台，向下培养孔加入适量类器官培养基，培养基的水平面不得超过上面的细胞凝胶层，这样就可以形成ALI微环境。

（6）将培养板放于培养箱，每2天换一次液，大概7-10天，多数类器官直径在100um以上，可进行传代操作。

冻存

冻存要领：

类器官不需要消化（消化后的类器官复苏活率低）；

在类器官指数增长期冻存（等到该传代的时候类器官活性比指数期差），也就传代后的Day3-Day4，多数类器官直径在100um-200um，这个时机选择冻存。

一、类器官收集及洗涤

1、收集：用移液器吸去下培养孔的培养基，向每个细胞小室添加1mL左右4℃类器官传代培养缓冲液G，轻柔吹散基质胶和类器官，收集在15mL离心管中（24孔板，每5个细胞小室孔为一组）。

2、洗涤：加类器官传代培养缓冲液G定容至14mL（缓冲液越多，基质胶被稀释的越充分，越容易去除），4℃静置40min或-20℃放置5min（目的是使基质胶软化，如果冰箱保温效果强，缩短冷冻时间，摸索合适的冷冻时间时，可取出离心管摇晃看不到基质胶说明冷化好了）。

3、接下来将离心管进行300g，4℃，离心5min，离心完通常会有这两种情况：

第一种是正常情况，分成三层（如下图），此时弃掉上清和基质胶层，保留类器官沉淀即可。

第二种是不正常情况，分成两层（如下图），这种情况可能与冷化不充分有关。此时弃掉缓冲液，留下基质胶类器官混悬液，重复上一步洗涤步骤，再次冷化离心，通常能出现清晰分层（缓冲液层、基质胶层、类器官沉淀层），此时弃掉上清和基质胶层，保留类器官沉淀即可。如果依然是两层（缓冲液层和基质胶类器官混悬液层），此时弃掉缓冲液和上1/3的基质胶类器官混悬液，保留下2/3即可。

促进基质胶和类器官有效分离条件：

a. 离心机的选择非常重要，水平角离心机相比固定角离心机更利于基质胶和类器官分离；

b. 离心机的温度最好是4℃（可避免基质胶固化），离心转速可适当提高（最高不要超过500g），离心时间可适当加长（最常不超过10min）。

二、类器官冻存

1、冻存密度，以细胞小室（PET膜，6.5mm，孔径0.4um，含24孔板）(abs7280)为例

密度建议1：2个细胞小室孔/mL冻存液

密度建议2：500个类器官/mL冻存液（如果想计数冻存，可以参照此密度建议）

2、添加适量类器官冻存液 F，轻柔吹打重悬，建议立即进行冻存。（放置太久，DMSO对类器官有损伤）

3、梯度冻存：将冻存管放入梯度冻存盒然后保存至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐。

     手动冻存：4℃冰箱放置30min，转移至-20℃放置1h，然后移至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐。

复苏

一、实验前准备

1、将水浴锅预热至37℃；

2、细胞实验室进行常规消毒，用预防喷雾喷涂并且使用紫外线照射40min的超净工作台台面；

3、在超净工作台中按次序摆好消过毒的离心管、吸管、培养板等。

二、细胞小室底层凝胶基质的制备

1、基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化；

2、枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时；

3、融化后的基质胶可一直放4℃储存，建议2周内用完；

4、在细胞培养超级净台中，用100uL枪头吸取50uL基质胶加入细胞小室（注意铺展均匀），将小室放入24孔板，将孔板放入培养箱，静置40-60min直到基质胶凝固为止。

三、取出冻存管

1、根据类器官冻存记录按标签找到所需类器官的编号；

2、从液氮罐中取出冻存盒，取出所需的冻存管，同时核对冻存管外的编号。

四、迅速解冻

1、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中解冻，并要不断地摇动，使管中地液体迅速融化；

2、约1-2min后冻存管内液体wan全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管地外壁，再拿入超净台内。

五、将类器官冻存液移入15mL离心管，添加10倍体积类器官传代培养缓冲液G（缓冲液体积：冻存液体积=10:1）重悬，轻柔吹打混匀，300g 4℃离心5min，弃上清。

六、加胶-点板-加液

1、准备工作

（1）基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化；

（2）枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时；

（3）融化后的基质胶可一直放4℃储存，建议2周内用完。

2、复苏要求

细胞小室（PET膜，6.5mm，孔径0.4um，含24孔板）(abs7280)，每个细胞小室孔加入50uL基质胶细胞团混合物。

3、复苏密度

复苏密度建议1：1:1接种（原来冻了几个细胞小室孔就复苏几个细胞小室孔）；

复苏密度建议2：500个类器官/50uL基质胶（如果想计数接种，可以参照此密度建议）

4、加胶-点板

向细胞团沉淀加入基质胶(abs9495)，进行吹打混匀（不要满吹满打，容易产生气泡），向每个铺了基质凝胶的小室内加入50uL细胞团基质胶混悬物，（整个操作在金属冰盒或冰上进行，操作熟练以后，加胶，混匀，点板控制在半分钟内，有利于保持基质胶良好的流畅性）。将铺好的培养板放入37℃培养箱中40-60min成胶。

5、加液

含组织的上层凝胶凝固以后，将24孔板放入超净台，向下培养孔加入适量类器官培养基，培养基的水平面不得超过上面的细胞凝胶层，这样就可以形成ALI微环境。

6、培养

将培养板放于培养箱，每2天换一次液，大概10-14天，多数类器官直径在100um以上，可进行传代操作。

今天讲解就到这了，大家如有实验问题，欢迎公众号“爱必信生物”后台交流哦！

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