人神经元特异性烯醇化酶 ELISA 检测试剂盒说明书

人神经元特异性烯醇化酶 ELISA 检测试剂盒

用 途：
人NSE ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织、缓冲液中细胞上清液及各种体液中的NSE 。本试剂盒可以检测天然和重组的NSE 。本试剂盒于科研、而非用于临床诊断。

试验原理：
人NSE 试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知NSE 浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将NSE 和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中NSE 的浓度呈比例关系。

试剂盒内容及其配制
试剂盒成份（2-8℃保存） 96孔配置 48孔配置 配制
96/48人份酶标板 1块板（96T） 半块板（48T） 即用型
塑料膜板盖 1块 半块 即用型
标准品：80ng/ml 1瓶（0.6ml） 1瓶（0.3ml） 按说明书进行稀稀
空白对照 1瓶（1.0ml） 1瓶（0.5ml） 即用型
标准品稀释缓冲液 1瓶（5ml） 1瓶（2.5ml） 即用型
生物素标记的抗NSE抗体 1瓶（6ml） 1瓶（3.0ml） 即用型
亲和链酶素-HRP 1瓶（10ml） 1瓶（5.0ml） 即用型
洗涤缓冲液 1瓶（60ml） 1瓶（30ml） 按说明书进行稀释
底物A 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用型
底物B 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用型
终止液 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用型

自备材料
蒸馏水。
加样器：5ul、10 ul、50 ul、100 ul、200、500 u、1000lul。
振荡器及磁力搅拌器等。

安全性
此试剂盒的人血制品中的HbsAg、和抗HIV为阴性，但没有实验室可*保证此血制品不会传染肝炎、AIDS或其它传染病，依据当地的安全条例处理本试剂盒里的成份及血清和血浆等样品。
避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

操作注意事项
试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。
加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

样品收集、处理及保存方法
血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。
细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。
保存------如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70 ℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

试剂的准备
标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行：
80 ng/ml （6号标准品） 原倍浓度不用稀释直接加入50ul。
40 ng/ml （5号标准品） 100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液
20 ng/ml （4号标准品） 100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液
10 ng/ml （3号标准品） 100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液
5.0 ng/ml （2号标准品） 100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液
2.5 ng/ml （1号标准品） 100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液
0 ng/ml （空白对照） 原始浓度不用稀释直接加入50ul。

洗涤缓冲液（20×）的稀释：蒸馏水20倍稀释。

操作步骤
使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。
加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。
甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作四次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作四次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育15分钟。避免光照。
取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
在450nm波长处测定各孔的OD值。

建议使用的实验方案
标准品浓度（ng/ml）
A 80 80 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品
B 40 40 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品
C 20 20 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品
D 10 10 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品
E 5.0 5.0 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品
F 2.5 2.5 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品
G 0 0 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品
H 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品

结果分析
以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的NSE 标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的NSE 含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。

局限
6号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到的结果。

试剂盒性能
灵敏度：zui小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。
特异性：不与人其它细胞因子反应。
重复性：板内、板间变异系数均小于10%。