基因表达的精确调控是神经发育、可塑性和认知功能的基础。尽管对发育中的人类大脑的转录调控已有研究，但对伴随的翻译调控还知之甚少。
2022年，哈佛医学院神经生物学系Erin E. Duffy 等人在《Nature Neuroscience》期刊上（IF25.0，一区）发表了论文《Developmental Dynamics of RNA Translation in the Human Brain》，该研究深入探讨了人类大脑发育过程中RNA翻译的动态变化。联合使用核糖体印迹测序（ribosome profiling，Ribo-seq）和RNA测序（RNA-seq）技术绘制了人类大脑的翻译图谱，揭示了基因表达调控的关键节点，并识别了数千个之前未知的翻译事件，包括产生人类大脑特异性微蛋白（microproteins）的小开放阅读框（sORFs）。
研究材料
30个产前大脑皮质样本（孕龄范围从12至23周）和43个成人大脑样本（18至82岁），平均尸检间隔9.9小时；人胚胎干细胞（hESC）衍生的神经元细胞。
研究方法
利用Ribo-seq和RNA-seq技术对73个人类产前和成人大脑皮层样本进行分析，定量评估大脑中活跃的mRNA翻译，识别高置信度的ORFs。使用质谱检测（蛋白质组学）验证关于ncRNA预测的蛋白质产物。采用细胞培养、基因过表达、蛋白亚细胞定位实验进一步研究和验证sORF翻译的微蛋白。
研究结果
1.构建人类产前和成人大脑的翻译景观
RNA-seq提供了大脑中的mRNA的表达谱，而Ribo-seq可以定量评估活跃的mRNA翻译。通过观察Ribo-seq数据中的三碱基周期性，确认了活跃翻译的核糖体位置。共识别到172,187个活跃翻译ORFs，映射到13,305个基因。还检测到与典型ORF相比，非规范ORF使用非AUG起始密码子的频率更高。总之，这些数据绘制了人类大脑皮层在整个发育过程中的翻译景观。
图1. Ribo-seq捕获成人和产前大脑中的活跃翻译。
2.人脑发育过程中的转录和翻译协调
通过配对的转录组和翻译组数据比较，揭示了几种不同的发育调控模式，包括缓冲（buffered）、强化（intensified）、仅转录调节（mRNA transcription/stability）和仅翻译调控（exclusively translationally regulated）。这种协调的翻译调控可能反映了mTOR信号传导的发育变化。
图2. 人类大脑发育的转录和翻译调控。
3.人脑中的sORF和非规范翻译
研究集中于鉴定和分析sORFs，这些sORFs通常编码长度不超过100个氨基酸的微蛋白。识别了源自8278个基因的38,187个活跃sORFs，其中许多来源于之前注释为非编码的转录本，包括长链非编码RNA（lincRNAs）、假基因和反义转录本。另外，还发现与典型ORF相比，sORF的核糖体密度更低。不过sORF的低翻译水平现象与许多先前的报道相似。许多sORF通过RNA丰度及翻译效率的协调变化进行发育调节，这可能使得随着大脑发育成熟，sORF蛋白水平得以微调。之后，通过将质谱检测结果与Ribo-seq结果进行匹配，在蛋白质水平上独立证实了这些sORFs的翻译，进一步提高了检测sORFs衍生微蛋白的能力。
图3. 大脑发育过程中的微蛋白表达和验证。
4.人类神经元中的sORF翻译的调控
在培养的hESC衍生神经元细胞中，研究了活动依赖的翻译图谱。三尖杉酯碱是一种小分子药物，可在翻译启动后立即固定核糖体，并导致核糖体足迹积累在起始位点。因此，使用三尖杉酯碱对培养的人神经元进行翻译抑制和Ribo-seq检测，补充了对人类死后脑组织的分析。通过进一步分析，发现了许多来源于先前注释为ncRNA的新型sORF，实际上可以被翻译。此外，还使用蛋白质组学分析对ncRNA的许多预测蛋白质产物进行了生化验证。这些翻译的ncRNA，其中包括LINC00473，一种先前被鉴定为灵长类特异性且活动依赖性的lincRNA。因此，LINC00473和许多其他先前注释的神经元活动依赖性ncRNA被翻译，以产生可能调节关键神经元的微蛋白。
图4. hESC衍生神经元中的活动依赖性翻译。
5.sORF的进化保守性
使用基因组系统进化学方法，分析了大脑sORFs的进化起源，并发现大多数sORFs是人类专有的。还发现在基因组中进化保守的区域更有可能被翻译，在未来这些高度保守的sORF更有希望作为功能研究的候选者。
图5. 人脑 sORF 的进化起源。
6.uORF对规范蛋白质翻译的调控
探讨了上游开放阅读框（uORFs）在调控典型ORFs翻译中的作用，发现某些uORFs与下游典型ORFs的翻译呈现负相关。例如：DLGAP1中uORF的翻译在产前样本中得到了强烈富集，并且与典型DLGAP1 蛋白翻译减少相关。这表明了一种机制，即在产前大脑而非成熟大脑中优先使用替代转录起始位点（TSS）会导致典型DLGAP1蛋白的特异性翻译抑制。
图6. uORF表达对下游ORF翻译的影响。
7.脑微蛋白功能的理化分析
研究人员通过对sORF进行序列分析，预测了微蛋白的物理化学特性，并探讨了它们可能的生物学功能。31%的sORF与已知或预测的人类蛋白质具有显著的序列相似性。而对于缺乏序列相似性的sORF，通过计算分析FoldIndex分数，发现这些蛋白质产物的三维构象通常不稳定。然而，许多无序蛋白质最近被证明可以通过多种机制发挥重要的细胞功能，包括调整蛋白质相互作用的特异性和亲和力，以及通过形成生物分子凝聚体。另外，还发现富含精氨酸-甘氨酸-甘氨酸（RGG）基序的序列簇在脑sORF中强烈富集。值得注意的是，RG和RGG基序对于mRNA剪接和翻译调节至关重要，并且还与RNA结合以及生物分子凝聚体的形成有关。因此，这些新鉴定的sORF编码的微蛋白，也可能与RNA加工复合物相互作用，进而控制细胞核中mRNA剪接、翻译或DNA损伤反应。
图7. 微蛋白质的功能表征。
8.对选定的人脑微蛋白进行体外验证
在异源细胞中过表达选定的sORF，确认了预期分子量的微蛋白的表达，然而在突变起始密码子后阻止了这些微蛋白的翻译。这进一步证明这些sORF可以有效翻译以产生稳定的蛋白质。此外，翻译的微蛋白表现出一系列亚细胞定位模式。因此，在异源细胞中的表达，为独立验证这些新鉴定的人脑微蛋白的翻译潜力和生物学功能提供了有用的策略和方法。
本文小结
通过在死后人脑组织和培养的hESC衍生神经元细胞中进行研究，揭示了人类大脑翻译组的复杂性，并指出了非典型ORFs在大脑发育和疾病中的潜在作用。该研究提供了人类大脑翻译调控的全面资源，为未来研究翻译调控在神经系统中的作用以及阐明许多新的人类大脑特异性微蛋白的功能提供了宝贵的资源和新的研究方向。
研究局限性与未来方向
研究考虑了包括样本处理、ORF预测算法的准确性、以及翻译启动和延伸步骤的区分等在内的多个限制因素。未来的研究需要进一步探索sORFs的功能，以及它们在人类大脑发育和疾病中的潜在作用。
参考文献: Duffy EE, Finander B, Choi G,et al. Developmental dynamics of RNA translation in the human brain. Nat Neurosci. 2022 Oct;25(10):1353-1365.
