免疫细胞培养攻略之样本制备（一）

免疫细胞(immune cells)是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等，其在免疫细胞疗法中扮演着至关重要的角色。免疫细胞疗法，即通过采集身体中的免疫细胞，经过体外培养，扩增，最后回输到体内，来增强机体对疾病的抵抗能力。因此免疫细胞培养至关重要。

为此，小爱创建了《免疫细胞培养攻略合集》，将为大家详细地介绍免疫细胞培养的六个基本流程：样本制备、细胞分选、分型鉴定、扩增&培养、质量优化、后续研究。今天我们先一起学习样本制备！

图1 免疫细胞分化历程及相关细胞因子（图源网络）

除此之外，我们也要了解免疫细胞在血液以及各免疫器官中的分布及比例，如此，我们才能选择目的免疫细胞相对富集的样本进行单细胞悬液的制备。以下列举了人外周血，小鼠脾脏、外周血和淋巴结中免疫细胞的比例，供大家参考（表1和表2）。

表1 人外周血免疫细胞的比例

表2 小鼠脾脏、外周血、淋巴结免疫细胞的比例

实验步骤

一、样本制备预处理

在正式的样本制备之前，我们还需进行样本采集和预处理。根据目的免疫细胞的分化以及血液和免疫器官分布，选择合适的样本，新鲜取材，并进行相关的预处理。

血液：从血液中制备PBMC是分离特定免疫细胞亚群的一个常见方法。采集血液样品后，要装入含适当抗凝剂的容器中防止凝集，并且血液要与抗凝剂充分轻柔混匀。不同的抗凝剂其抗凝原理略有不同，小爱也为大家整理了常见抗凝剂的原理及优缺点（表3）。目前来说，适合后续免疫细胞培养的抗凝剂是肝素抗凝剂。

表3 常用抗凝剂汇总

实体组织：实体组织的预处理相对简单，主要是组织的清洗。使用培养基或PBS等清洗组织上残留的血液，并剔除相关的结缔组织，整合过程中也一定要保证无菌。

注意事项：

1）样本的取材一定要新鲜无菌，这样才能保证细胞的状态；

2）血液要与抗凝剂轻柔混匀，剧烈晃动可导致溶血；

3）血液采集后，需进行检测以保证质量及无菌。

二、样本制备

样本制备(Sample Preparation)：免疫细胞的来源可分为血液和各种实体组织，由此，样本制备的方法则分为PBMC的制备和实体组织制备成单细胞悬液。

1、单个核细胞(PBMC)的制备方法主要是密度梯度离心，其原理为血液中各细胞成分的比重存在差异，利用比重为1.077、近于等渗的人淋巴细胞分离液(Ficoll)作密度梯度离心时，各成分将按密度梯度聚集。

具体步骤如下：

1）准备无菌的15mL离心管或锥形管； 

2）加入人淋巴细胞分离液(abs930)5mL。（注意：淋巴细胞分离液使用前需恢复室温，18-25℃）；

3）Hank‘s液(abs9257)或PBS(abs962)缓冲液1:1比例（如果全血样本粘稠，可适当增大比例）稀释抗凝过的全血样品；

4）小心沿着壁管，接近分离液层面，非常缓慢地加入新鲜的稀释过的4mL全血样品在淋巴细胞分离液上面（注意：切记不要搅浑淋巴细胞分离液）；

5）小心放进离心机（水平转子），4℃离心25min，速度为500g，在此过程中升降速度降至1，避免产生细胞融合；

6）小心取出离心管（切记不要震动），弃掉上层黄色的液体，吸取中间层的白色薄膜层，即为PMBC（如图2）；

图2 抗凝血中加入Ficoll后图示（左）；离心分层后图示（右图）

7）用10mL PBS洗涤获得的PBMC，离心10min，转速250g，在此过程中升降速度降至1，避免产生细胞融合，弃上清；

8）重复洗涤一次并重悬细胞备用。

注意事项：

1）人淋巴细胞分离液(Ficoll)和血液（现取现用）在实验前恢复至室温（18-25℃为宜）并颠倒混匀，防止淋巴细胞分离液低温时密度增加和红细胞低温时聚集，以减少PBMC被红细胞污染；

2）为保持淋巴细胞的活性，血液最好选取采血2h以内的新鲜抗凝血液；如需对分离的淋巴细胞进行进一步的培养和检测，请在采血和分离过程中注意无菌操作；

3）稀释或洗涤缓冲液，不可使用含钙、镁离子的缓冲液，以免导致血细胞凝聚；

4）离心倾倒收获细胞前，也可先吸取采集或丢弃最上层血浆层，有助于减少细胞被血小板污染；

5）过多吸取淋巴细胞白膜层以外的成分，会导致交界处的一些粒细胞或血小板等被混入；

6）由于不同血液样本间的差异，可能对分离效果产生影响。可根据实际情况适当调整离心力和时间，参考离心力和时间范围为：400-1000g、20-30min；

7）将血液和淋巴细胞分离液混合一定时间后，出现红细胞沉降属于正常现象。

2、实体组织制备成单细胞悬液：传统的实体组织解离成单细胞悬液的方法有机械法、酶解法和化学法。小爱也为大家整理了这三种方法的原理、适用范围及优缺点（表4）。

表4 组织制备单细胞悬液传统方法的区别

联合使用机械法和酶解法获得单细胞悬液是很常用的方法，步骤如下：

所需试剂、耗材、器械与仪器：

试剂：DMEM培养基(abs9483)，红细胞裂解液(abs9101)

耗材：1.5mL离心管(abs7119)，15mL离心管(abs7120)，50mL离心管(abs7121)，一次性无菌过滤器(70µm)(abs7306)

器械: 眼科剪、眼科镊

仪器：恒温摇床，离心机

操作步骤：

1）取新鲜组织100mg左右加至无菌离心管中，用眼科剪将组织剪碎至1-2mm³ ，加入组织解离液(abs9482)1mL；

2）将离心管置于恒温摇床上，37℃/180rpm震荡孵育60min消化组织，可根据组织的不同适当延长消化时间；

3）孵育结束后将离心管内的组织匀浆用70µm无菌过滤器过滤，然后加入细胞培养基冲洗无菌过滤器，用50mL的离心管收集滤液；

4）将细胞悬液1200rpm离心5min，弃上清；

5）再加入适量培养基，1200rpm离心5min，弃上清；

6）用细胞培养基重悬细胞，取少量细胞镜下观察消化情况；

7）根据需要将细胞用于后续实验；

8）（可选）可使用红细胞裂解液去除组织解离过程中的红细胞。

注意事项：

1）组织解离液可根据实际使用量进行分装，置于-20℃保存，随用随取，避免反复冻融；

2）组织解离液2-8℃保存应不超过48h，2-8℃长时间保存会降低产品的解离效果；

3）若组织解离获取的细胞用于细胞培养，应保证所有操作均在无菌条件下完成。 

实验结果图

适用于多种组织的解离，解离后细胞活率高。

abs9482将小鼠心脏组织处理为单细胞悬液后做流式：细胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色结果

abs9482将小鼠肝脏处理为单细胞悬液后做流式：细胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色结果

abs9482将小鼠肠道组织处理为单细胞悬液后做流式：细胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色结果

abs9482将小鼠脾脏处理为单细胞悬液后做流式：细胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色结果

abs9482将小鼠肿瘤组织处理为单细胞悬液后做流式：细胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色结果

今天讲解就到这了，下一期我们讲解细胞分选，大家如有细胞培养问题，欢迎后台交流哦！

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