如何充分利用 Seraseq® FFPE 参考材料-化工仪器网-手机版

大多数肿瘤分析检测工作流程使用福尔马林固定和石蜡包埋 (FFPE) 的组织活检样本，该过程会给组织标本中的核酸带来化学损伤。从 FFPE 组织中提取的 DNA 中可能会发现脱嘌呤、脱嘧啶、脱氨、氧化、缺口和双链断裂，从而导致核酸碎片化。胞嘧啶脱氨会导致测序结果不正确，并可能影响 FFPE DNA 样本中较低频率变异的准确识别，但所有类型的损伤都会影响测序质量（例如覆盖均匀性）和下游基因组分析。1

为了评估核酸损伤和提取方法对NGS的影响为了评估结果并验证分析工作流程对 FFPE 样本的适用性，应包括全流程 FFPE 参考材料。但是，它应该代表真实样本才有用。1 LGC Clinical Diagnostics开发了一系列此类参考材料，用于分析 DNA 变体、RNA 融合和复杂的基因组特征（TMB、MSI 和 HRD），包括模拟存档组织活检标本损伤和尺寸分布的受损 FFPE DNA 产品。

从 FFPE 样本中获得的 DNA 产量、完整性、测序指标和测量的变异等位基因频率 (VAF) 可能因使用的提取试剂盒而有很大差异。2这种差异可能是由于不同片段长度的 DNA 的相对提取效率不同，以及在使用相应试剂盒进行 DNA 分离过程中逆转甲醛损伤的偏差。

虽然 Seraseq ® FFPE 参考材料保证每卷 DNA 产量 >100 ng 或 RNA >400 ng，但这仅适用于使用与 LGC Clinical Diagnostics 用于产品发布测试的相同提取试剂盒的情况，因为产量可能会有所不同（见表 1）。虽然较低的产量不会影响下游结果，但最大限度地提高核酸提取的性能可确保将足够的样本输入到不同的测序方案中。以下是一些有助于防止产量低和样本损失的建议，重点是 DNA 提取。

FFPE DNA 提取产量（ng）
材料	QIAamp DNA FFPE 组织	麦克斯韦 RSC DNA FFPE	FFPE 预处理
Seraseq ®破坏 FFPE 肿瘤 DNA	177±50 375±148 #	384±51 290±82 #	551±151 #
Seraseq ® FFPE HRD 高阳性	165±41	136±55	161±22*
Seraseq ® FFPE HRD 低阳性	235±68	122±39	293±44*
Seraseq ® FFPE HRD 阴性	505±191	200±77	315±10*
Seraseq ®淋巴瘤 FFPE DNA	193±44 #	124±11 #	不适用
FFPE RNA 提取产量（ng）
材料	AllPrep DNA/RNA FFPE	麦克斯韦 RSC RNA FFPE	安科特福尔马普
Seraseq ® FFPE 融合 RNA v4 RM	1021±240 774±178*	170±28 238±77*	1177±255
Seraseq ® FFPE WT	不适用	不适用	449±35
Seraseq ®受损 FFPE WT	不适用	不适用	1278±187

表 1.不同 Seraseq ® FFPE 参考材料获得的 DNA 和 RNA 产量的差异。对于所有值，± 表示一个标准差；除非另有说明，否则数据代表单个批次的材料。#所有发布批次的平均内部数据 * 来自外部实验室的数据。

从生物合成 FFPE 样本中提取 DNA 的成功步骤

Seraseq ®样本颗粒比临床样本的颗粒更小、更透明，可能难以看到。采取以下预防措施可能会有所帮助：

将 Seraseq ®样本与临床样本一起提取，以便直观地追踪样本。
在管子和盖子的外侧做上标记，然后将其放入离心机中，使标记朝向转子的外侧（预计有沉淀物的位置）。
当使用需要丢弃上清液的协议时，如果对沉淀的位置有任何疑问，请在前几次运行中保存上清液。

使用自动化方案提取的 DNA 产量往往低于相应的手动方案。使用自动化提取系统时，我们始终建议使用参考材料（例如 Seraseq ® WT FFPE 材料）验证新的自动化仪器。

QIAamp®DNA FFPE 组织试剂盒 (Qiagen)

可以将 1 mL 二甲苯直接加入装有卷曲的产品管小瓶中（图 3A），以避免卷曲转移。撕掉产品管标签可能会有所帮助，以便更好地查看管内的内容。如果需要将卷曲转移到新小瓶中，我们建议尝试将产品小瓶放在另一个小瓶顶部，轻拍它，避免使用镊子。或者，您可以先在原始管中溶解卷曲，然后将所有内容物转移到新管中。
脱蜡后去除二甲苯时，要谨慎。只取出 900 uL，其余留在小瓶中，以免扰乱沉淀物。在加入乙醇之前，在化学罩内风干。
只有在加入乙醇沉淀后，DNA 才会显现出来。如果不容易看见，可在涡旋后倒置小瓶几次以观察它。沉淀物应呈白色胶状物质（图 3B）。离心后，沉淀物应在管底呈颗粒状清晰可见（图 3C）。
离心沉淀后，尽可能多地除去上清液，但要小心避免扰动和/或吸出沉淀物。使用较小尺寸的移液器可能会有所帮助。

Maxwell® RSC DNA FFPE 试剂盒（Promega）

熔化和脱蜡孵育温度至关重要；温度过高会导致 DNA 产量降低，因为样本中单链 DNA 过多。将小瓶密封也很重要。
没有沉淀，因此丢失样品的风险较低。然而，在 RNAse 之后去除水层时必须小心一种处理方法，避免转移任何变性的蛋白质界面，因为它会堵塞墨盒并降低产量。

AllPrep® DNA /RNA FFPE 试剂盒 (Qiagen)

遵循与 QIAamp ® DNA FFPE 组织试剂盒类似的总体预防措施
在用蛋白酶 K 处理之前将沉淀物重新悬浮在缓冲液 PKD 中时，可以通过用力添加缓冲液将其去除来实现可视化。
如果不是同时提取 RNA，则在去除上清液时要谨慎，以免丢失 DNA。

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