免疫卫士-T细胞培养攻略

T细胞作为免疫系统的卫士，肩负着适应性免疫的重担，在细胞免疫和体液免疫都有着关键性的作用。不仅如此，基于T细胞的三大免疫疗法：CAR-T、TCRT、TILs也在“遍地开花”。截止目前，FDA共批准了6款CAR-T产品，中国也上市了5款CAR-T产品，全球共有11款CAR-T产品获批！2024年2月16日，全球shou款TIL疗法- lifileucel（LN-144）获批上市，用于治疗晚期黑色素瘤，成为有望攻克实体瘤的又一把利剑。
类器官与T细胞的共培养也是一大研究“爆点”：T细胞与肿瘤类器官共培养，可为优化个性化实体瘤靶向细胞疗法提供支持[1]，也可基于类器官免疫共培养技术的药物筛选平台，筛选出能改善肿瘤免疫原性的表观遗传调节药物[2]。
不可否认的是，这些巨大成就都依赖于T细胞的体外培养，那么T细胞的体外扩增培养又是如何实现的呢？小优接下来会从T细胞来源---培养---激活---扩增---分化---活力维持---功能检测---热门研究八个方面给大家介绍。
敲黑板：T细胞之外你还想了解哪些细胞？更多惊喜文末等着你~

1.T细胞来源
可来源于捐献者的血液或者其他实体组织样本，进而通过样本制备、细胞分选等操作获得高纯度高活性的T细胞。具体样本制备和细胞分选的内容，小伙伴们可以参考之前的文章：《免疫细胞培养通关技巧之样本制备》和《免疫细胞培养通关技巧之细胞分选》。用于癌症治疗的原代T细胞通常来自自体（患者）或同种异体（非患者）供体。自体样本是CAR-T疗法等过继细胞治疗的标准做法，有助于避免在输回患者体内时与非自身抗原发生自身免疫反应。在这些情况下，培养和扩增工程化T细胞至关重要，因为癌症患者的天然T细胞数量通常会减少。
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2.T细胞培养
培养体系
可使用经典的培养体系，即基础培养基（实验室中培养T细胞常用的培养基是RPMI-1640）+胎牛血清或者无血清培养基。需要注意的是，胎牛血清作为动物源制品，若培养的T细胞后续用于人类治疗时则需慎重，小优更倾向于推荐大家使用无血清的培养体系。
 

图1含血清和无血清培养体系的区别

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培养条件
T细胞的培养温度为37°C；CO2 浓度通常为5%；此外，也需要防止细菌、真菌、支原体、内毒素、病毒等污染物的出现。这部分的内容大家可以参考《免疫细胞培养通关技巧之质量优化》。
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3.T细胞激活
自然状态下，T细胞的激活需要两个信号：第一个信号T细胞上的抗原特异性T细胞受体（TCR/CD3）与抗原提呈细胞（APC）上的抗原肽-MHC分子复合物的相互作用，即抗原识别过程，第一信号是T细胞活化所必须的，但不能引起T细胞增殖和细胞因子释放。当T细胞表面表达的共刺激分子与APC表达的配体相结合时，就生成了第二个T细胞激活信号，其中最重要的是T细胞表面CD28分子与APC表面相应配体B7-1(CD80)和B7-2(CD86)的结合。而在体外培养T细胞时，则借助CD3和CD28抗体来模拟两个激活信号。另外，也可以将CD3和CD28抗体偶联磁珠或多聚体以激活T细胞，或者使用商品化的激活扩增试剂盒。

图2 T细胞的体内体外激活示意图

抗体法[3]：在体外联合使用抗CD3和CD28的抗体刺激T细胞，抗CD3单克隆抗体识别 TCR-CD3复合体上CD3分子的ε链并相互作用，从而增强T淋巴细胞的活化与增殖。抗CD28单克隆抗体与B7-CD28复合体上的CD28分子相互作用，能提供有效的共刺激信号，激发T细胞增殖，可诱导T细胞的分化、增殖和IL-2等细胞因子的分泌。从而模拟T细胞活化的双信号作用。
a)  使用anti-human CD3抗体（无菌PBS稀释）包被24孔板，包被浓度1μg/mL；室温放置4 h（也可4℃包被过夜），吸去未结合的抗体悬液；
b)  每孔加入500 μL含1%BSA的PBS溶液进行封闭，室温30 min，结束后用无菌PBS洗涤1次；
c)  PBMC接种于上述24孔板中，接种密度1*106/mL，培养体系为含10%热灭活胎牛血清、1%双抗、3μg/mL anti-human CD28、100 IU/mL human IL-2的RPMI-1640培养基；
d)  培养3天后，收集细胞，计数，台盼蓝染色检测细胞活力，用于进一步分析。

磁珠法：以美天旎T Cell TransAct™, huma为例：在100nm右旋糖苷基质上分别耦联人源化的CD3、CD28抗体，高效模拟抗原递呈过程，实现高效、持久的T细胞激活。使用时，按照体积比1:100加入即可。
 

图3 不同孔板对应的T细胞密度及所需激活试剂体积

注意事项：
原代T细胞一般在体外的培养时间不超过三周，用于功能实验的T细胞建议培养时间在14天以内。
抗体法中CD3和CD28的包被浓度需要摸索确定，一般为1-10ug/ml，且多采用CD3包被，CD28游离的方法。
磁珠法中，磁珠分为微米级和纳米级，以T Cell TransAct™, human（130-128-758，纳米级）和T Cell Activation/Expansion Kit, human（130-091-441，微米级）为例， 130-128-758（微米级）是通过换液，或者离心清洗就可以去除，130-091-441（微米级）则通过MACSiMAG分选器去除磁珠和抗体。
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4.T细胞扩增
T细胞扩增使研究人员能够生成大量T细胞，以最大限度地发挥治疗潜力。通常会在培养物中添加特定细胞因子，例如白细胞介素2 (IL-2) 或 IL-7/IL-15，以支持T细胞扩增和存活。21年一篇文献发现：T细胞密度为2.5×105 cell/mL时的扩增效果优于较高或较低密度，且在高于50 IU/mL的IL-2浓度下表现出更高的扩增效率[4]。当需要大量抗原特异性T细胞时，可以反复接触抗原以激活T细胞从而达到扩增的目的，但是反复激活的方法应谨慎使用，因为它会导致T细胞衰竭和功能下降。在扩增阶段，可以观察T细胞克隆团的形成、检测细胞增殖情况或者流式细胞术检测相应的细胞标记物。
 

图4 T细胞扩增阶段形成的克隆团[5]

5.T细胞分化
不同类型的效应T细胞在免疫调节网络中发挥着核心作用，该网络充当人体的防线，并在疾病状态下引发免疫反应。如Th1细胞因子在识别和清除细胞内病原体如病毒和细菌，包括结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌和利什曼原虫方面起着重要作用；Th2细胞介导针对细胞外寄生虫、细菌、过敏原和毒素免疫反应的活化和维持；Th17细胞在宿主防御细胞外病原体中发挥作用；Treg对维持自身耐受性和免疫细胞稳态至关重要。T细胞体外诱导分化需要添加的细胞因子或抗体大家可以参考图5，同时小优也给大家汇总了一份体外诱导T细胞分化方案（图6）。

图5 Naïve T细胞在不同抗体或细胞因子作用下诱导分化为对应亚型

 图6 体外诱导T细胞分化方案[6]

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6.T细胞活力维持
T细胞活力对于任何T细胞培养实验或治疗的成功都至关重要，在这里需要确认三个方面的因素：避免T细胞培养密度过高而出现密度抑制的现象；确保培养体系可以提供T细胞必需的营养物质和生长因子；保证培养环境的无菌。

7.T细胞功能检测
一旦培养出足够数量的T细胞，就可以通过各种实验方法来评估T细胞的表型、功能和活力，比如：
细胞毒性试验：测量T细胞杀死靶细胞（例如癌细胞或感染细胞）的能力。
ELISpot检测：酶联免疫吸附斑点（ELISpot)实验可量化特定细胞因子的分泌，从而了解T细胞的功能。
流式细胞术：可用于分析T细胞的表面标志物、胞内蛋白及信号转导。
 

图7 T细胞不同亚型的表面标记物、转录因子以及分泌的细胞因子

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8.T细胞热门研究
小优以发表在Nature Protocols的《Tumor organoid–T-cell coculture systems》中描述的肿瘤类器官与T细胞共培养为例给大家介绍：
类器官part：在开始共培养之前，需从肿瘤组织中获取肿瘤细胞建立肿瘤类器官，在共培养前两天从基质胶中分离肿瘤类器官，共培养前一天用IFN-γ进行刺激，共培养当天，将肿瘤类器官解离成单细胞。
T细胞part：从外周血中分离PBMC，具体的操作方法也可以参考《免疫细胞培养通关技巧之样本制备》。
共培养part： 将肿瘤类器官单细胞悬液与PBMC一起培养在涂有anti-CD28的培养皿中，并加入IL2和anti-PD1。共培养一周后，将新的肿瘤类器官解离成单细胞悬液再次刺激PBMC。共培养两周后，可冻存T细胞（黄色）、评估T细胞对肿瘤细胞的反应性（绿色）或进行肿瘤类器官杀伤实验（蓝色）。
 

图8 肿瘤类器官- T细胞共培养系统流程图[7]

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注意事项：
共培养前使用IFN-γ刺激肿瘤类器官的目的是使后续共培养时抗原呈递zui大化
共培养时加入anti-PD1是为了抵消IFN-γ对PD-L1的诱导
肿瘤类器官与免疫细胞共培养时，需要精确控制免疫细胞比例及激活状态
免疫系统对肿瘤的反应是动态变化的，包括免疫监视、免疫逃逸和肿瘤免疫编辑等过程，这些都需要在模型中得到有效模拟

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T细胞之外你还想了解哪些细胞？
除了免疫卫士-T细胞，人体还有许多细胞在“卖力工作”（图5）。人体有四大组织：神经组织、结缔组织、上皮组织、肌肉组织。每种细胞都有其存在的价值和研究的意义：神经元活动与情绪调节和心理健康紧密相关，研究神经元有助于理解抑郁症、焦虑症等心理疾病的成因；成纤维细胞与肿瘤细胞之间的相互作用影响肿瘤的生长和转移，了解这些相互作用有助于开发抗癌策略；巨噬细胞作为固有免疫的关键细胞，可参与炎症、肿瘤免疫、自身免疫疾病等多种生理病理过程。

图5 人体四大组织及对应细胞类型

1.  Dekkers, J.F., et al., Uncovering the mode of action of engineered T cells in patient cancer organoids. Nature Biotechnology, 2022. 41(1): p. 60-69.
2.  Zhou, Z., et al., A T Cell‐Engaging Tumor Organoid Platform for Pancreatic Cancer Immunotherapy. Advanced Science, 2023. 10(23).
3.  Soltantoye, T., et al., Soluble and Immobilized Anti-CD3/28 Distinctively Expand and Differentiate Primary Human T Cells: An Implication for Adoptive T Cell Therapy. Iranian Journal of Allergy, Asthma and Immunology, 2022.
4.  Ghaffari, S., et al., Optimizing interleukin-2 concentration, seeding density and bead-to-cell ratio of T-cell expansion for adoptive immunotherapy. BMC Immunology, 2021. 22(1).
5.  Zhang, D.K.Y., A.S. Cheung, and D.J. Mooney, Activation and expansion of human T cells using artificial antigen-presenting cell scaffolds. Nature Protocols, 2020. 15(3): p. 773-798.
6.  Sekiya, T. and A. Yoshimura, In Vitro Th Differentiation Protocol, in TGF-β Signaling. 2016. p. 183-191.
7.  Cattaneo, C.M., et al., Tumor organoid–T-cell coculture systems. Nature Protocols, 2019. 15(1): p. 15-39.
  

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