小核酸药物是目前发展最为迅猛的基因疗法之一，将带来“除小分子药和抗体药”之外的第三次制药浪潮。小核酸药物包括反义寡核苷酸（ASO）、小干扰RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）、信使RNA（mRNA）、适配体（aptamer）等。其中，ASO药物是小核酸药物领域发现最早、获批最多的药物类别，也是该领域研发的重要方向之一。
一、ASO药物作用机制
反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASO）指与靶基因mRNA互补的一段单链DNA或RNA序列，长度通常为15-25nt，通过碱基配对原则与其互补的RNA结合，可以调节靶RNA的功能。ASO的作用机制主要分为两大类：一类是基于RNase H1-介导的mRNA降解机制(图1A所示）；另一大类是基于ASO结合带来的空间位阻，封闭mRNA关键区域，从而影响mRNA的成熟或者翻译为蛋白质（图1B所示）。
图1 ASO作用机制（图片来源：Nature Reviews Drug Discovery, 2020, 19(10): 673-694）
二、ASO药物体外代谢研究策略
和传统小分子药物一样，在药物临床前研究阶段，通常需要对ASO药物进行体外代谢研究，并提供代谢途径及其产物相关信息。ASO药物的代谢酶主要为核酸外切酶和核酸内切酶，广泛分布于血液和各个组织器官，一个合适的体外代谢研究体系，能够最·大程度地预测体内的情况，对于ASO药物的早期筛选非常重要。表1所示为常用的ASO药物体外代谢研究体系。
表1 ASO药物的体外代谢研究体系
生物基质 | 试验类型 | 备注 |
血清/血浆 | 代谢稳定性，血浆蛋白结合试验 | 金属螯合剂抗凝的血浆不适合代谢稳定性研究；ASO药物血浆蛋白结合试验可选择超滤法和超速离心法。 |
肝S9 | 代谢稳定性，代谢产物鉴定 | 肝S9一定程度上可以代替肝组织匀浆使用。 |
肝微粒体 | 代谢稳定性 | 肝微粒体的核酸酶活性较低，但也有文献报道人肝微粒体也能代谢ASO化合物。 |
肝组织匀浆 | 代谢稳定性，代谢产物鉴定 | 酶体系比较全面，推荐用于ASO药物的体外筛选评价。 |
肝细胞 | 代谢产物鉴定，细胞摄取试验 | 肝细胞酶体系最为完善，适用于肝靶向的ASO药物研究。 |
溶酶体 | 代谢稳定性 | 溶酶体具有丰富的酶体系，包括核酸酶和各种水解酶等，是研究ASO药物代谢稳定性的高效实验体系。 |
脑组织匀浆、脑脊液 | 代谢稳定性，脑组织匀浆和脑脊液蛋白结合试验 | 对于神经系统及神经肌肉适应症类的ASO药物，可选择脑组织匀浆和脑脊液进行体外相关研究。 |
需要指出的是，在药物研发前期只用1-2个体外代谢体系去正确预测体内稳定性或代谢情况是非常困难的。因此建议在早期ASO药物筛选时进行多体系代谢研究相互验证，不断优化试验方案，进而选择与体内相关性最佳的体外代谢体系进行筛选研究。
三、IPHASE相关产品
为满足客户对于ASO药物体外代谢研究的需求，IPHASE作为体外研究生物试剂引·领者，凭借先进的设备，专业的技术人员和多年研发的经验，开发出来多种用于ASO药物体外代谢研究的产品，助力广大客户进行ASO药物早期筛选研究。
类别 | 分类 |
亚细胞组分 | 肝溶酶体 |
酸化肝匀浆液 | |
肝/肠/肾/肺S9 | |
肝/肠/肾/肺微粒体 | |
肝/肠/肾/肺胞质液 | |
原代肝细胞 | 悬浮肝细胞 |
贴壁肝细胞 | |
专属血浆 | 血浆稳定性 |
血浆蛋白结合 | |
空白生物基质 | 空白脑组织 |
空白脑脊液 |
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