植物蛋白质提取方法总汇

                                  植物蛋白质提取方法总汇

一、植物组织蛋白质提取方法
1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液,可根据材料不同适当加入）,准备提取液放在冰上.
　　2、把样品放在研钵中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上静置（3～4小时）.
　　3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃.
　　4、提取上清夜,样品制备完成.
蛋白质提取液：300ml
　　1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml
　　2、甘油（Glycerol）75ml
　　3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g
这种方法针对SDS-PAGE,垂直板电泳！
 

二、植物组织蛋白质提取方法
三氯醋酸-丙酮沉淀法
　　1、在液氮中研磨叶片.
　　2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜,然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清.
　　3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇）,摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时）,然后真空干燥沉淀,备用.
　　4、上样前加入裂解液,室温放置30分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准）,可临时保存在4℃待用.
　　5、用Brandford法定量蛋白,然后可分装放入-80℃备用.
药品：
　　提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮
　　裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml）,使用前再加入1M的DTT65ul/ml.
这种方法针对双向电泳,杂质少,离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用,只是电泳的条带会减少！
 

三、组织：肠黏膜
目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达
应用TRIPURE提取蛋白质步骤：
　　含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）
　　倒转混匀,置室温10min
　　离心：12000g,10min,4度,弃上清
　　加入0.3M盐酸胍/95%乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量）
　　振荡,置室温20min
　　离心：7500g,5 min,4度,弃上清
　　重复0.3M盐酸胍/95%乙醇步2次
　　沉淀中加入100%乙醇 2ml
　　充分振荡混匀,置室温20min
　　离心：7500g,5min,4度,弃上清吹干沉淀
　　1%SDS溶解沉淀
　　离心：10000g,10min,4度
　　取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT）
存在的问题：加入1%SDS后沉淀不溶解,还是很大的一块,4度离心后又多了白色沉定,SDS结晶测浓度,含量才1mg/ml左右.
解决：提蛋白试剂盒,另外组织大小适中,要碎,立即加2X BUFFER,然后煮5～10分钟,效果很好的.
 

四、植物材料：水稻苗,叶鞘,根
1、200毫克样品置于冰上磨碎
　　2、加lysis buffer,离心,10000rpm,4度,5min取上清
　　3、重复离心5min
　　lysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40
 

五、蛋白质样品制备
秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行.
100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40（聚乙烯吡咯烷酮）及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml10% 三氯yi酸（丙酮配制,含10mM即0.07%β-巯基乙醇）,混匀,-20℃沉淀1小时,4℃,15000r/min离心15min,弃上清,沉淀复溶于 1.5ml冷丙酮（含10mMβ-巯基乙醇）,再于-20℃沉淀1小时,同上离心弃上清,（有必要再用80%丙酮（含10mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干.
按每mg干粉加入20μl（可调）UKS液[9.5 M尿素,5mM碳酸钾,1.25%SDS,0.5%DTT（二硫苏糖醇）,2% Ampholine （Amersham Pharmacia Biotech Inc,pH3.5～10）,6% Triton X-100],37℃温育30min,期间搅动几次,28度（温度低,高浓度的尿素会让溶液结冰）16000r/min离心15min,离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳.或者-70度保存.
 

六、植物根中蛋白质的抽取
（1） sample,液氮研磨
　　（2） 装1.5ml centrifuge 用tube
　　（3） 加1M KH2PO4+K2HPO4 700 ul
　　（4） 12000rpm,4度,10～15minite
　　（5） 取上层液,蛋白质就在里面.