在细胞培养和保存过程中，支原体污染是一个常见且棘手的问题。支原体是一类微小的原核生物，它们能够附着在细胞表面或通过细胞膜进入细胞内，对细胞生长和实验结果产生显著影响。对于需要长期保存和频繁复苏的冻存细胞而言，防止支原体污染尤为重要。本文将从多个方面探讨如何有效避免冻存细胞被支原体污染。
一、源头控制：确保起始细胞的无菌状态
1. 严格筛选起始细胞
在进行细胞冻存之前，必须确保起始细胞的无菌状态。这包括通过显微镜观察细胞形态、使用特定的培养基和试剂进行支原体检测等。一旦发现细胞中存在支原体污染，应立即采取措施进行清除或重新获取无菌的起始细胞。
2. 使用支原体敏感的细胞系进行监测
有些细胞系对支原体污染特别敏感，可以作为监测工具来检测培养环境中的支原体污染情况。定期使用这些细胞系进行培养试验，可以及时发现并处理潜在的污染问题。
二、操作规范：遵循无菌操作原则
1. 无菌操作环境
细胞培养应在专用的无菌操作台或生物安全柜中进行，确保操作环境的洁净度。操作前应对操作台和周围环境进行清洁和消毒，以减少微生物污染的风险。
2. 严格的无菌操作技术
操作人员应严格遵守无菌操作规范，如佩戴无菌手套、使用无菌器具、避免交叉污染等。在操作过程中，应尽量减少对细胞的直接操作次数和时间，以降低污染风险。
三、培养基与试剂的质控
1. 选择高质量的培养基和试剂
培养基和试剂的质量直接影响细胞的生长状态和污染风险。因此，在选择培养基和试剂时，应优先考虑那些经过严格质量控制、无支原体污染的产品。
2. 定期检测培养基和试剂
即使是可靠产品也有可能存在污染风险。因此，建议定期对培养基和试剂进行支原体检测，以确保其无菌状态。一旦发现污染，应立即停止使用并更换新的产品。
四、冻存与复苏过程中的防污染措施
1. 冻存前的处理
在细胞冻存之前，应对细胞进行清洗和更换培养基，以去除可能存在的支原体和其他微生物。同时，应确保冻存液的无菌状态，并在添加冻存液前进行过滤处理以去除潜在的污染物。
2. 冻存过程中的控制
细胞冻存过程中应尽量避免温度的剧烈波动和时间的延长，以减少支原体和其他微生物的生长机会。同时，应确保冻存容器的密封性和无菌状态，以防止外部污染物的侵入。
3. 复苏后的处理
细胞复苏后应立即进行支原体检测，以确保复苏过程中未引入新的污染源。同时，应对复苏后的细胞进行密切的观察和监测，及时发现并处理潜在的污染问题。
五、定期监测与应急处理
1. 定期监测细胞状态
定期对细胞进行形态学观察和支原体检测是预防污染的重要措施。通过定期监测可以及时发现细胞生长异常和污染情况，并采取相应的处理措施。
2. 建立应急处理机制
一旦发现细胞污染情况，应立即启动应急处理机制。这包括隔离受污染的细胞、追溯污染源、采取适当的消毒措施以及重新获取无菌的起始细胞等。
避免冻存细胞被支原体污染需要从多个方面入手，包括源头控制、操作规范、培养基与试剂的质控、冻存与复苏过程中的防污染措施以及定期监测与应急处理等。只有在这些方面都做到严格控制和科学管理，才能有效避免支原体污染对细胞培养和实验结果的影响。
