细胞复苏是指将冻存在液氮或者-70℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养,细胞恢复生长的过程。当恢复到常温状态时,细胞的形态结构保持正常,生化反即刻恢复。细胞复苏过程升温要快,原则是慢冻快融,防止在解冻过程中水分进入细胞,形成冰晶,影响细胞存活。下面让我们一起来看看细胞复苏实验的操作步骤与注意事项吧!
一、操作步骤
1.将10ml移液管、移液枪、1ml枪头、50ml离心管、T25培养瓶、酒精灯、废液缸等物品放入超净工作台,紫外灯照射30min后再通风30min;
2.预热培养基;
3.用75%酒精消毒后放入超净工作台;
4.将冻存细胞从液氮罐中取出;
5.放入一次性手套于37℃水浴锅中快速晃动使其融化;
6.用75%酒精消毒后放入超净工作台;
7.吸取9ml培养基到50ml离心管中;
8.用1ml枪头吸取解冻的细胞悬液于离心管中;
9.1000r/min,离心5min;
10.用75%酒精消毒后放入超净工作台;
11.吸弃上清液;
12.吸取1ml培养基重悬细胞,将细胞悬液转移到培养瓶内,补加适量培养基,轻轻晃动培养瓶使细胞分布均匀,并做好标记;
13.在显微镜下观察复苏的细胞密度及状态;
14.将细胞放回二氧化碳培养箱中静置培养。
二、注意事项
1.从液氮罐中取出细胞时,应做好个人防护以免冻伤;
2.冻存细胞取出后,如不能立即放入水浴锅中融化,需将其放在干冰上保存转移;
3.细胞水浴解冻时间以1min内为宜,做到慢冻速融;
4.已解冻的细胞避免长时间常温存放,需尽快离心去除DMSO;
5.刚复苏的细胞贴壁尚不牢固,24h内不要频繁观察和换液;
6.将培养瓶放入培养箱,并将瓶盖旋松,以便进行充分的气体交换(如使用透气性瓶盖,则无需旋松瓶盖)。
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