1. 蛋白质色谱介质的创新－新型色谱介质的合成
1.1 双孔与超大孔色谱介质
色谱介质是蛋白质色谱的核心构件。目前商业化蛋白质色谱介质的孔道尺寸多在100 nm以下，孔道对蛋白质分子的（扩散）传质存在严重地阻滞作用，导致色谱柱效、处理能力（动态吸附容量）和分离度的显著降低。上世纪80年代后，若干研究相继报道了利用孔内对流传质改善色谱介质孔内传质的实验结果。基于这一思路，1990年前后Afeyan等人合成了聚苯乙烯-二乙烯基苯POROS®介质[1]。POROS®介质同时具有600－800nm的对流孔以及连接这些对流孔、孔径在50－150nm的扩散孔。POROS®介质内蛋白质分子通过对流传质而迅速到达色谱配基附近；而连接对流孔间的扩散孔在缩短扩散距离（<1 μm）的同时也提供了较大的比表面积，从而确保了色谱介质的高吸附容量。受此启发，一系列基于不同材料和合成方法的大孔、超大孔蛋白质色谱介质相继问世。天津大学孙彦等人分别以碳酸钙颗粒和水为致孔剂合成了具备超大孔结构的琼脂糖、纤维素以及聚甲基丙烯酸环氧丙酯（GMA）-甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA）等色谱介质[3]。蛋白质分子在超大孔琼脂糖离子交换色谱介质内的有效扩散系数为传统琼脂糖色谱介质的2倍以上，动态吸附容量提高了50%并且在300－1800 cm/h的线性速度范围内柱效基本恒定[4]。
1.2 微滤膜和整体柱
另一种引入微米级孔道结构的方法是以微滤膜为色谱介质。这种以微滤膜为色谱介质的色谱分离方法称为膜色谱。微滤膜的孔径通常在0.22
μm以上，在跨膜压差作用下料液中的蛋白质分子以主体流动的方式流经微滤膜，接近膜孔表面的色谱配基。因此，膜色谱可以实现高流速下目标蛋白质的快速分离。由于微滤膜内无扩散孔且膜厚度有限（100-200 μm），膜色谱的处理能力和柱效通常很低，因此更多地应用于亲和色谱中。
整体柱技术是解决上述瓶颈的有效方法。整体柱的色谱介质是在色谱柱内通过原位聚合方法合成的柱状多孔固定相，其可看作是若干叠加的微滤膜。与超大孔色谱介质粒子类似，整体柱内同时具备微米级的对流孔和纳米级的扩散孔[5]。与膜色谱相比，整体柱内扩散孔提供了更大的吸附面积，解决了膜色谱处理能力低的问题。与填充超大孔粒子的常规固定床色谱相比，整体柱的制备方法更便捷、重现性更好；整体柱的空隙率几可忽略不计（填充床色谱柱通常在0.3-0.5之间），处理能力得以显著提升；流经整体柱的流动相均以主体流动方式穿过对流孔，传质速率更快。
在此基础上，孙彦等人构想了一个整体柱色谱的理想结构模型，如图1所示
[3]。整体柱的对流孔由内径
1－5μm、紧密排布且平行于色谱柱轴向的六角直管构成；六角直管管壁的多孔骨架（图1中灰色部分）则形成整体柱的扩散孔，其厚度为1－5μm。色谱过程中，流动相可径直流经色谱柱，有效地降低了流动相的流动阻力。构成扩散孔的多孔骨架一方面缩短了蛋白质分子孔内扩散距离，实现了蛋白质分子与吸附位点的快速结合；另一方面，多孔骨架提供了更大的吸附面积，提高了吸附容量。因此，整体柱在满足流动相高传质速率的同时，确保了蛋白的高吸附容量。但该方法的实现还需要在材料、合成工艺方面的进一步创新。
图1 理想色谱介质的结构示意图[3]
1.3 葡聚糖接枝离子交换色谱介质
近来，一种以Sepharose XL系列介质为代表的离子交换色谱介质引起了广泛关注。这类介质是通过将葡聚糖接枝于常规色谱介质的孔道表面，进而偶联离子交换配基的方法得到的。Stone等人的研究表明，接枝分子量为40kDa葡聚糖的Sepharose 6B色谱介质的孔径由19.4 nm降低到6.1 nm；但在葡聚糖接枝的离子交换色谱介质内，溶菌酶的有效扩散系数却可达其在自由溶液中的5-10倍[6]；同时，蛋白质的饱和吸附量也有明显提高[7]。
蛋白质色谱的处理能力不仅取决于传质速率也与介质的饱和吸附量有关。受限于蛋白质在水溶液中的溶解度，蛋白质在色谱介质上的吸附容量往往低于500 mg/mL[8]。在有限的吸附容量条件下，选择性吸附目标蛋白成为今后蛋白质色谱发展的一个重要方向。这方面的研究工作已经有了一些非常有益的尝试[3]。
2. 蛋白质色谱的过程集成－膨胀床色谱
2.1 膨胀床色谱的方法和优势
细胞培养的粗料液中不仅含有目标蛋白还包括大量共存的可溶性（如杂蛋白、核酸等）及不可溶性杂质（如细胞碎片等），因此需要引入额外的单元操作来处理共存的杂质。这势必导致目标蛋白收率的降低。在生物分离过程中，多个单元操作的过程集成是解决这一问题的有效途径之一。
膨胀床色谱就是这样的一种将细胞（碎片）分离、蛋白吸附和目标蛋白回收等步骤集成的色谱分离技术。膨胀床色谱柱的顶部和底部分别安装有可调节高度的高度调节器和可自由通过细胞碎片的流体分布器。色谱柱内填充的具有一定粒径和密度分布的色谱介质；当流动相自柱底高速流入时，色谱介质在流动相的作用下流态化，沿色谱柱轴向形成稳定的粒径和（或）密度分布，床层的空隙率大为提高（可到0.8以上），粗料液中的细胞或细胞碎片等固体杂质可自由通过。膨胀床色谱可认为是一种稳定的流化床模式；与常规流化床相比，膨胀床色谱中流动相以近平推流的方式流经色谱柱，固、液两相返混程度较低，近似于固定床色谱。因此，膨胀床色谱技术适用于从含有固形杂质的粗料液中回收目标产物。
2.2 膨胀床色谱介质及分级特性
膨胀床色谱成功的关键在于开发的色谱介质。表1列出了若干商品化膨胀床色谱介质的特性参数。为了适应膨胀床色谱高流速操作的需要，理想的膨胀床色谱介质应当具有较高的密度和较短的介质内传质路径，高密度小粒径色谱介质和薄壳型色谱介质成为了膨胀床色谱介质的发展方向。孙彦等人先后开发了多种琼脂糖包裹高密度惰性材料（如氧化锆-硅胶、玻璃珠等）的高密度薄壳型膨胀床色谱介质[3]。在相同的操作条件下，琼脂糖包裹玻璃珠的薄壳型色素亲和色谱介质的动态吸附容量可达商业化膨胀床色谱介质的2倍以上[9]。
表1 商品化的膨胀床色谱介质及主要特性（Spherodex，预装柱，琼脂糖凝胶，美国GE）
| 名称 | 材料 | 粒径分布 （μm） | 介质密度 （g/mL） |
| Streamline 系列介质 | 琼脂糖包埋微米级石英砂颗粒 | 100－300 | ～1.2 |
| Rhobust Fastline介质 | 琼脂糖包埋碳化钨颗粒 | 20－200 | 3.0 （2.5－3.5） |
| Spherodex系列介质 Spherosil LS系列介质 AG-S[3] AG-L[3] | 硅胶表面偶联葡聚糖 硅胶表面偶联硅烷醇 琼脂糖包裹氧化锆-硅胶颗粒 小玻璃珠/4%琼脂糖薄层 大玻璃珠/4%琼脂糖薄层 | 100－300 ～190 ～136 70－190 130－280 | － 1.34 2.39 1.77 1.98 |
填充于色谱柱中的膨胀床色谱介质在流动相流速的作用下沿色谱柱轴向方向形成稳定的粒径和密度分布。这种分布取决于由Stokes沉降速率方程确定的色谱介质的终端速度，其中终端速度大的色谱介质主要分布于色谱柱底部，终端速度小的色谱介质分布于色谱柱顶部。孙彦等人研究结果表明，6%琼脂糖包埋石英砂颗粒的Streamline介质在膨胀床色谱轴向存在着明显的粒径分布（80－500 μm）而无密度分布；由此相反，6%琼脂糖包裹不锈钢微球的6AS介质则沿色谱柱轴向呈现显著的密度分布[10]。色谱介质沿膨胀床色谱轴向的这种粒径或密度分布可与柱内采样高度（h）很好地关联。周鑫等人对琼脂糖包裹不同粒径玻璃珠的薄壳型色谱介质的分级规律研究结果进一步显示，膨胀床色谱内介质的轴向密度分布随着介质密度的增大而越加显著；当介质密度很大时，介质沿轴向呈现明显的密度分布，粒径分布则可忽略[11]。周鑫等人提出了如下的经验方程关联介质在膨胀床内的粒径和密度分布[11]，
（1）
其中，S为，
（2）
在膨胀床色谱过程中，固相介质的分级特性还受到溶液组成、性质等因素的影响。杨征和孙彦发现，当流动相的粘度由低变高时，膨胀床色谱柱底的空隙率持续增大；而色谱柱中部和上部的空隙率则由于底部介质向上的挤压作用而呈现先降后升的规律
[12]。
Fenandez-Lahore等人发现，处理含有细胞的粗料液过程中，膨胀床的空隙率必须超过80%以确保操作的稳定性
[13]。
2.3 膨胀床色谱的应用
膨胀床色谱已成功地应用于不同蛋白质的分离纯化过程。Clemmitt和Chase利用Streamline Chelating介质从大肠杆菌细胞匀浆液中直接提取了含有组氨酸标签的谷胱甘肽转移酶，收率达到80%以上 [14]。同时，膨胀床色谱也受到了产业界的关注。DSM生物技术公司的Doeven和Boer利用装填MabDirect Protein A的膨胀床色谱柱直接从CHO细胞培养液（50L）中捕集单抗，单抗的收率和纯度均不低于现有工艺[15]。
3. 蛋白质色谱的过程强化－电色谱技术
电色谱是一种在外加电场作用下的液相色谱分离技术。在电色谱过程中，流动相在电渗流、压力流的推动下流经色谱柱，其间荷电溶质的传质源自主体流动、电泳和电渗流等的共同作用。上世纪五、六十年代，研究人员开始尝试将电场引入到色谱分离过程中并报道了分离血清蛋白的成功案例[16]。在电色谱过程中，液相主体流动的推动力来自压力和电渗作用；溶质在色谱介质内的输送则通过扩散传质和电动传质完成。现有的实验和理论分析结果显示，外加电场可诱导色谱介质内液相发生主体流动。这与此前介绍的蛋白质在对流孔内的传质行为异曲同工，可显著提高蛋白质在孔内传质速率，进而提高色谱柱的柱效。另一方面，由于色谱介质孔道对传质的阻滞作用和对蛋白分子的空间排阻作用，蛋白质在介质内的传质速率通常要明显小于其在主体液相中的传质速率，由此导致蛋白分子在色谱介质表面的“累积”，形成浓差极化（concentration polarization）现象。浓差极化现象为电色谱过程中的蛋白质分子提供了一个新的保留机理。
色谱过程中的电场主要是通过轴向电场和横向交变电场两种方式引入的。目前报道的多数制备型电色谱是通过外加轴向电场的方式实现的，其中电场强度方向与流动相的流动方向平行。在轴向电场作用下的电色谱中，外加电压与色谱柱高成正比，因此色谱放大过程中色谱柱高的加长会导致外加电压的升高和操作成本的增加。另外，高电压的应用也会产生大量的焦耳热和电解气，由此带来色谱柱散热困难和电解气的“累积”，影响到电色谱操作的稳定性。为了解决上述问题，孙彦等人提出了横向交变电场的电色谱技术 [17]，即色谱过程中电场强度的方向垂直于流动相的流动方向。带有横向交变电场的电色谱柱由位于中间的凝胶室及其两侧的电解液室构成，凝胶室与电解室之间采用装填25%聚丙烯酰胺凝胶的多孔陶瓷板隔开。这种新型电色谱柱设计缩短了电极的距离，从而确保了用较低电压获得所需的电场强度。孙彦等人将此电色谱成功地应用于凝胶过滤色谱、离子交换色谱和亲和色谱分离蛋白质的过程中。贾国栋等人对比了不同的电场引入方式对电色谱性能的影响[18]。结果如表2所示。从中可以看出，在外电场的作用下，色谱的处理能力（用δ50表示）要明显高于无外加电场的常规色谱。
表2 不同外电场模式下色谱处理能力（δ50值）的比较
| 电场 | 横向交变电场 | 轴向电场 | 二维电场 |
| 60mA | 100mA | 10mA | 20mA |
| δ50 | 2.4 | 3.8 | 2.4 | NA* | 4.5 |
4. 展望
作为生物下游的核心技术之一，蛋白质色谱技术一直受到学界和产业界的广泛关注并取得了长足的进步。在今后相当长的阶段，蛋白质色谱技术的创新、过程的优化和理论的完善仍将是蛋白质色谱发展的主要方向。同时，蛋白质分子界面现象的准确描述和蛋白质吸附机理的正确阐述也将为蛋白质色谱技术的化提供科学的指导。因此，可以预见未来蛋白质色谱技术的研究将是由多种先进的实验技术和研究手段支撑的、在多个尺度上共同开展并相互关联的理论和实践工作。这将为生物技术产业的发展提供强有力的支撑。
符号说明
a 方程（1）中的常数，无因次；
b 方程（1）中的常数，无因次；
D 采样高度处的平均粒径，μm；
D0 色谱介质的平均粒径，μm；
h 柱内采样高度，m；
H 膨胀状态下床层的高度，m；
S 方程（2）确定的参数，无因次；
ρ 采样高度处介质的平均密度，g/mL；
ρ0 色谱介质的平均密度，g/mL；
ρL 流动相溶液的密度，g/mL；
δ50 电场作用下色谱的动态吸附容量与常规色谱的动态吸附容量之比，无因次
