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IS-OGP：提升传统显微镜在光遗传学中的应用

光遗传学是一种利用光来控制活体组织内细胞活动的技术。这可以是从广泛照射脑组织以刺激实验室动物的特定活动，到监测单个神经元水平的通路。光遗传学的一个关键要求是能够精确地将光定向到实验对象，主要是在显微镜下进行。

许多生物过程是基于离子浓度梯度在两个亲水区域之间，通过脂质膜的差异来进行的。例如，线粒体中的能量是以质子（pH）梯度的形式产生的，肌肉细胞的收缩是由钠（Na+）和钙（Ca2+）离子梯度介导的，而神经脉冲的传递涉及钠（Na+）和钾（K+）离子的流动。

几十年来，研究人员在所谓的“膜片钳”研究中使用微小机电探针研究和操纵这些电位；通常，微管电极插入细胞或对外膜形成密封。而现在，光遗传学领域为这个谜题的另一面带来了光子解决方案，即操纵这些细胞间的电位差。

第一个光遗传学实验利用了天然存在的、光激活的蛋白质，称为视蛋白，用于充当特定离子的泵。一旦实验原理被成功证明，研究会很快扩展到一系列的通道视紫红质和其他类别的基因编码工具（例如，C1V1）。这些光遗传激活剂为科学家提供了一种机制，可以在毫秒内使用适当波长和强度的光来打开或关闭目标细胞（例如，肌肉细胞、大脑皮层神经元）。

光遗传学在生命科学研究中具有极其广泛的应用，从观察孤立细胞的活动，到刺激实验室动物的特定行为，再到研究大脑皮层中的神经通路。对于宏观应用，照明需求通常相对简单。在尺寸谱系的另一端，多光子激发显微镜使得在体内以单个神经元分辨率进行三维研究成为可能。在这些JI*端情况之间，许多实验可以在常规光学显微镜下最*效地进行，只要有一种方法可以准确地将一个或多个辅助光源（激光、LED或过滤灯）对准视野中的一个或多个目标。为了支持此类工作，新一代的光机电模块提供了一种成本效益高的方法，将一个可外部控制的次级光源集成到诸如蔡司（Zeiss）、尼康（Nikon）和奥林巴斯（Olymous）等领*xian制造商的传统三目显微镜中。操作原理很简单（见图1）：将45°分束器放置在显微镜主体（管）的无限空间中。具体来说，二向色、带通或其他分束器被固定在一个紧凑的滑块组件中，该滑块组件在显微镜主体和三目镜头之间机械地吻合。一旦将滑块机制安装在显微镜中，分光器就可以从显微镜的光学路径中插入或撤出，甚至可以更换为另一个分光器，而无需任何机械干扰或拆卸。

图1. 光学机械模块，例如Siskiyou IS-OGP，提供了一种成本效益高的方法，用于将一个可外部控制的次级光源集成到传统的三目显微镜中。一个45°的二向色镜、带通或其他分光器被固定在一个紧凑的滑块组件中，该组件在显微镜主体和三目头之间机械地嵌合。滑块允许分光器无缝插入和从显微镜光路中撤出，甚至可以更换为另一个分光器。

从单模光纤耦合的准直器输入的准直光通过一个精密的XY双挠性支架横向输入到组件中（见图2）。显微镜物镜将结果光点聚焦在样本平面上。光点直径取决于光的波长和物镜的倍数；使用常规的20X物镜，488nm的光通常被聚焦到大约5μm的极限光点直径。在支架中调整准直器可以使得使用20倍物镜时光点直径从5μm变化到50μm。

图2.IS-OGP是Siskiyou公司的一个模块化子组件，它将来自输入单模光纤的光束校准，并通过45°分光器将其引导至直立显微镜的视野中的任何位置。产生的光点具有可调直径，并且可以通过机械（差动螺钉）或自动化执行器精确定位或扫描。

紧凑型准直器配置有标准的FC-female输入插座，因此可以接受通过单模光纤传输的任何光源。双挠性jian*端/倾斜安装装置提供了简单调整聚焦点位置的功能——与基于双轴平移的替代方法相比，背隙得到最小化。焦平面的微调灵敏度再次取决于物镜的功率，但与显微镜筒长无关。当使用20X物镜与本装置标准配备的微分螺钉时，粗调的每转大约为110μm，细调的每转为9μm。此外，柔性支架接受电机驱动器，适合那些希望实现自动控制的人。

使用由多个子模块组成的光学显微镜模块的另一个优势是成本效益的灵活性。例如，分束器滑块模块可以单独使用，以创建固定的、45°双向通向显微镜无限空间的访问。这使得可以使用额外的目镜、相机或其他成像设备；例如，带有偏振或带通滤光片的设备。

宾夕法尼亚大学Mahoney神经科学研究所的 Minghong Ma 教授和 Wenqin Luo 使用这种新的模块化设置进行他们的一些研究。Ma和Luo的研究小组正在使用光遗传刺激和贴片钳感测相结合的方法，在离体组织中研究嗅觉系统和脊髓中不同细胞类型是如何通过突触连接的。他们使用470nm激光刺激表达ChR2的神经元，并使用全细胞膜片钳技术监测其他“记录”细胞中的相应活动。

这些研究是在配备IS-OGP光遗传学定位器的Olympus正置显微镜（型号BX61）下进行的。Ma教授解释说：“这台多功能显微镜是近十年的老设备，对于多个研究项目来说是一个重要的共享资源。然而，对于光遗传学的一个限制是它只有一个辅助光源输入——一个配置用于荧光照明的后侧端口。我们的工作需要将这个端口专门用于表层荧光目的。ISOGP提供了一种wan美的方法，可以在不干扰或损害显微镜的其他功能和能力的情况下，引入一个额外的激光用于光遗传学。”

在Ma教授研究中的一个典型实验里，一个300到500μm厚的组织切片被放置在记录室中，并使用标准的含氧溶液保持其活力。荧光显微镜用于寻找表达ChR2的神经元轴突；然后使用差分干涉对比（DIC）成像来定位ChR2轴突旁的合适细胞。随后，使用贴片钳电极与该细胞接触，以便观察由于使用470纳米激光光（通过IS-OGP模块引入视野）选择性刺激ChR2轴突而引起的膜电位变化。典型数据图3所示。