流程
类器官原代培养流程
准备工作
1、仪器设备
CO2培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅(abs72023)或水浴摇床，医用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪刀、眼科镊。
2、试剂耗材
货号 | 品名 | 规格 | 储存条件 |
abs9932 | 人正常皮肤类器官培养基 | 100mL | 2-8℃，3个月 |
abs9931 | 类器官人正常皮肤原代组织消化液 | 10mL | -20℃，避免反复冻融，6个月；2-8℃, 避光保存，6个月 |
abs9751 | PBS-BSA润洗液 | 100mL | -20℃，有效期12个月 |
abs9731 | 类器官原代培养缓冲液 | 500mL | -20℃保存，有效期1年 |
abs9244 | 青霉素-链霉素溶液(100×,双抗) | 100mL | -20℃保存，有效期12个月 |
abs972 | 胎牛血清(优级) | 500mL | -15℃以下，有效期5年 |
abs9495 | 基质胶(低因子,无酚红) | 1.5mL×4 | 保存-80°C冰箱，有效期2年 |
abs9520 | 类器官传代消化液 | 100mL | -20°C，保质期12个月 |
abs9730 | 类器官传代培养缓冲液 | 500mL | -20℃保存，有效期1年 |
abs9519 | 类器官冻存液 | 100mL | -20°C，保质期12个月 |
abs7003 | 细胞培养皿(100mm) | 1箱 | 室温，保质期3年 |
abs7305 | 40μm 细胞筛网过滤 | 1箱 | 室温，保质期3年 |
abs7119 | 1.5mL离心管(无菌无酶) | 1箱 | 室温，保质期3年 |
abs7035 | 细胞培养板(标准透明24孔板) | 1箱 | 室温，保质期3年 |
abs7289 | 2mL低温金属冰盒(24孔,平底) | 1个 | 室温 |
类器官原代
一、使用前准备
A.组织消化液准备
使用前将皮肤组织消化液Ⅰ从-20℃环境取出，放置室温使其融化，待溶解后上下颠倒瓶身数次，使液体充分混匀；
皮肤组织消化液Ⅰ加入12.5mL类器官原代培养缓冲液，配置后，在标签上记录配制日期，于2-8℃冰箱避光保存；
注：皮肤组织消化液Ⅰ配制完成后，建议在1个月内使用完。
B.配置含有5%FBS、1%青霉素-链霉素的类器官原代培养缓冲液作为中和液用于终止消化；
注：本实验所用离心管、枪头等，需提前使用PBS-BSA润洗液进行润洗。
二、原代组织消化
1、将手术样本环形包皮组织展平于10cm培养皿中，用含有1%青霉素-链霉素的类器官原代培养缓冲液浸泡，反复漂洗，去除残留血液；
2、剔除组织的皮下结构，如脂肪、血管等，漂洗数次；
3、将组织均匀剪成0.5-1.5cm左右大小方块状，再次漂洗，直至漂洗液清澈；
4、将清洗后小块组织放入10mL新鲜配置的皮肤组织消化液Ⅰ中，表皮层朝下，置于4℃冰箱中过夜消化；
注：建议消化时间为12-14h；
5、消化过夜后，用无菌镊子轻轻牵拉，将包皮组织的表皮和真皮分离，收集表皮皮片；
6、用无菌眼科剪将表皮剪碎成糊状，置入培养皿中；
7、加入3mL皮肤组织消化液Ⅱ，于37℃的培养箱中消化10min；
8、将培养皿置于显微镜下观察消化情况；
注：可轻拍皿壁，镜下见大量漂浮游离的细胞亮点，即证明消化过程完毕，否则可适当延长消化时间。
9、消化完成后，加入3mL含有5%FBS、1%青霉素-链霉素的类器官原代培养缓冲液终止消化；
10、反复轻柔吹打，使细胞团块分散；
11、40μm细胞筛网过滤，过滤液收集至50mL离心管中；
12、4℃，300 x g，离心5min；
13、使用类器官原代培养缓冲液重悬细胞沉淀；
14、4℃，300 x g，离心5min；
15、离心后弃去上清，保留底部细胞沉淀；
16、按照4-0.6x10^6/mL的密度，加入适量的基质胶并吹打混匀10-15次。
注：此步骤速度要尽可能快，避免基质胶温度升高而凝固；吹打时注意不要产生气泡；
17、按照50μL/孔的量，将基质胶与类器官悬液滴加至24孔板中心成半球形状；
注：种板时操作确保迅速，避免基质胶温度升高而凝固；
18、将培养板置于37℃恒温培养箱中20min，放置过程中避免晃动培养板；
19、取出培养板，每孔加入wan全培养基500μL；
20、显微镜下观察类器官种板情况，培养板放入37℃细胞培养箱中继续培养。
类器官传代
一、使用前准备
A.类器官wan全培养基和传代消化液分装；
1、使用前按照每次用量分别分装wan全培养基和类器官消化液；
2、在配制好的wan全培养基和标签上记录配制日期，于2℃-8℃冰箱避光保存；
3、在配制好的消化液标签上记录配制日期，于-20℃冰箱避光保存；
注：建议wan全培养基在1-3个月内使用完；
B.基质胶
使用前将基质胶置于冰上或2℃-8℃冰箱2-3h解冻；
注：使用过程中保持基质胶在4℃以下（建议置于冰上保存），温度升高会致基质胶凝固而不可使用。
C.润洗
类器官操作过程中，所有离心管、枪头操作前均需润洗，避免类器官贴壁丢失；
二、传代步骤
类器官培养6-7天或者类器官直径大于100μm，可进行传代培养，传代前从培养箱内取出24孔板，放置倒置显微镜下观察有无污染或异常。
1、取50mL类器官传代培养缓冲液放于冰上预冷；
2、取出培养板，在生物安全柜中沿孔边缘吸去旧培养基；
3、每孔加入500uL类器官传代培养缓冲液，反复吹打使基质胶从板底脱落，将类器官转移至15mL离心管，用预冷类器官传代培养缓冲液定容至10mL；
4、使用1000μL枪头温和吹打混匀20-30次，使类器官从基质胶中洗脱出来，4℃放置40min或-20℃冷冻3-5min；
5、4℃，400 x g，离心5min；
6、离心结束弃上清及上层基质胶，保留细胞沉淀；向管内加入新的预冷类器官传代培养缓冲液6mL，1000μL枪头温和吹打混匀20-30次；
7、4℃，400 x g，离心5min；
8、离心后弃去上清，保留细胞沉淀，向离心管中加入2mL类器官传代消化液，用1000μL枪头温和吹打混匀，室温消化3-7min（期间用吹打混匀1-2次），用预冷类器官传代培养缓冲液定容至6mL；
注：消化并吹打结束后可取样镜下观察类器官消化情况，以类器官消化成单个细胞为宜；弃上清时操作要小心，避免吸液时类器官丢失；
9、4℃，400 x g，离心5min；
10、离心后弃去上清，保留底部细胞沉淀；
11、按照4-0.6x10^6/mL的密度，加入适量的基质胶并吹打混匀10-15次。
注：此步骤速度要尽可能快，避免基质胶温度升高而凝固；吹打时注意不要产生气泡；
12、按照50μL/孔的量，将基质胶与类器官悬液滴加至24孔板中心成半球形状；
注：种板时操作确保迅速，避免基质胶温度升高而凝固；
13、将培养板置于37℃恒温培养箱中20min，放置过程中避免晃动培养板；
14、取出培养板，每孔加入wan全培养基500μL；
15、显微镜下观察类器官种板情况，培养板放入37℃细胞培养箱中继续培养。
类器官冻存
一、使用前准备
A.类器官冻存液和消化液分装
1、使用前按照每次用量分别分装冻存液和类器官消化液；
2、分别在配制好的冻存液和消化液标签上记录配制日期，于-20℃冰箱避光保存；
B.润洗
类器官操作过程中，所有离心管、枪头操作前均需润洗，避免类器官贴壁丢失。
二、冻存步骤
类器官培养6-7天或者类器官直径大于50μm，可进行类器官冻存，冻存前从培养箱内取出24孔板，放置倒置显微镜下观察有无污染异常。
1、取50mL类器官传代培养缓冲液放于冰上预冷；
2、取出培养板，在生物安全柜中沿孔边缘吸去旧培养基；
3、每孔加入500uL类器官传代培养缓冲液，反复吹打使基质胶从板底脱落，将类器官转移至15mL离心管，用预冷类器官传代培养缓冲液定容至10mL；
4、使用1000μL枪头温和吹打混匀20-30次，使类器官从基质胶中洗脱出来，4℃放置40min或-20℃冷冻3-5min；
5、4℃，400 x g，离心5min；
6、离心结束弃上清及上层基质胶，保留细胞沉淀；向管内加入新的预冷类器官传代培养缓冲液5mL，1000μL枪头温和吹打混匀20-30次；
7、4℃，400 x g，离心5min；
8、离心后弃去上清，保留细胞沉淀，向离心管中加入2mL类器官传代消化液，用1000μL枪头温和吹打混匀，室温消化3-7min（期间用吹打混匀1-2次），用预冷类器官传代培养缓冲液定容至6mL；
注：消化并吹打结束后可取样镜下观察类器官消化情况，以类器官消化成单个细胞为宜；弃上清时操作要小心，避免吸液时类器官丢失；
9、4℃，400 x g，离心5min；
10、离心后弃去上清，保留底部细胞沉淀；
11、按照0.5x10^6cell/Vial（用户可根据需求决定冻存密度）向离心管中添加类器官冻存液；
12、充分混匀后，将悬液分装至细胞冻存管(1mL/Vial)；
13、放至程序性降温盒，并转移至-80℃冰箱，次日将类器官转移至液氮罐长期保存。
类器官复苏
一、使用前准备
A.wan全培养基分装
1、使用前按照每次用量分装wan全培养基；
2、在配制好的wan全培养基标签上记录配制日期，于2℃-8℃冰箱避光保存；
注：建议wan全培养基在1-3个月内使用完；
B.基质胶
使用前将基质胶置于冰上或2℃-8℃冰箱2-3h解冻；
注：使用过程中保持基质胶在4℃以下（建议置于冰上保存），温度升高会致基质胶凝固而不可使用。
C.润洗
类器官操作过程中，所有离心管、枪头操作前均需润洗，避免类器官贴壁丢失。
二、复苏步骤
复苏操作从冻存管解冻至放入培养箱培养过程控制在30min内，以确保足够的类器官存活。
1、准备低温、低速离心机一台，并将温度设定为4℃预冷；
2、加样枪头提前放置-20℃预冷，于加样前取出；24孔板提前放入37℃恒温培养箱预热；
3、基质胶提前放置冰上或4℃冰箱解冻；
4、15mL无菌离心管用PBS-BSA润洗液润洗后置于冰上预冷；
5、将wan全培养基从冰箱中取出，将温度平衡至室温；
6、将类器官从液氮存储管中取出，迅速将冻存管放入37℃水浴快速晃动1-2min，待冻存管内大部分冰块融化后取出；
注：从液氮罐取出类器官时，请严格按照实验室生物安全管理规定，做好防冻伤防护措施；
7、将冻存管放置于冰上，带入细胞间，用酒精棉球对管壁进行消毒后，在生物安全柜中将类器官悬液转移至预冷的15mL离心管内，加入5mL类器官传代培养缓冲液，使用润洗后的1000μL移液枪头轻轻吹打10次混匀；
8、4℃ ，300 x g 离心5min；离心后弃去上清保留沉淀；
注：离心后，仔细观察离心管底部，有一白色薄层沉淀，避免吸液时丢失类器官。
9、向离心管中加入600μL预冷的基质胶，轻轻混匀10-15次；
注：此步骤速度要尽可能快，避免基质胶温度升高而凝固；吹打时注意不要产生气泡；请根据细胞量适当调整密度；
10、按照50μL/孔的量，将基质胶与类器官悬液滴加至24孔板中心成半球形状；
注：种板时操作确保迅速，避免基质胶温度升高而凝固；
11、将培养板置于37℃恒温培养箱中孵育40min，放置过程中避免晃动培养板；
12、孵育完成后取出培养板，每孔加入wan全培养基500μL；
13、显微镜下观察类器官复苏情况，培养板放入37℃细胞培养箱中继续培养；
14、类器官换液：每2天更换一次新鲜培养基。
注：接种后每日观察，整个操作应遵守无菌操作规程。
今天讲解就到这了，大家如有实验问题，欢迎一起交流哦！
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