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RNA/DNA提取操作过程重难点汇总

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2024/9/19 14:36:16


       RNA和DNA对大家来说都非常熟悉,其本质都是核酸(一种由碳氢氧氮磷元素组成的化合物),只是在结构组成上有所不同,但是它们的基本组成单位都是核糖、磷酸和碱基。RNA中文叫核糖核酸,英文Ribonucleic Acid,与DNA相比,RNA的核糖比DNA多一个氧,因此DNA也称为脱氧核糖核酸,再者就是两者的碱基不同,RNA四种碱基主要是A/G/C/U,DNA是A/T/C/G。

      DNA的主要功能是记录遗传信息,而RNA主要功能是转录和翻译DNA的遗传信息,其实RNA还有其他的一些功能,比如RNA是很多病毒的遗传信息,RNA也具有一定的催化作用。

RNA/DNA提取过程中的注意事项:

1.避免污染

为避免RNase/DNase等污染,可以在操作前仔细清洁实验平台、试剂盒、器皿和工具等,并使用经RNase/DNase清洗的试剂和器皿。此外,应该尽可能快地进行样品提取,以减少RNA/DNA降解和污染的可能性。

2.明确目的和选择合适的方法

RNA和DNA在分子结构和物理化学特性上有所不同,并且不同的样本类型也有不同的组织结构和特征,因此需要根据实验目的和样本类型选择合适的RNA/DNA提取方法。例如,在提取RNA时,需要更加注意RNase的污染问题;而在提取DNA时,则需要更加注意DNA的不断降解问题。

3.优化样品破碎步骤

样品破碎对RNA/DNA提取至关重要。不同样品类型需要不同的破碎方法,如高压均质机、超声波等。在破碎过程中,需要注意破碎时间和功率控制,以避免过度破碎导致RNA/DNA的降解。

细胞破碎方法:超声波法、高压均质法、玻璃珠法等都是常用的细胞破碎方法。

4.RNA/DNA的纯化和浓缩

在提取和纯化RNA/DNA过程中,需要去除可能存在的污染物,如蛋白质、盐等,并尽可能地减少DNA和RNA的降解。此外,在进行RNA/DNA浓缩时,应根据实验要求选择合适的方法,如酚/氯仿法或柱层析法等。

5.对提取的RNA/DNA进行检测和评估

在提取RNA/DNA之后,需要对其进行确定性和质量评估。可以使用分光光度计和凝胶电泳等技术来测定RNA/DNA的浓度和质量,并评估是否存在RNase/DNase污染等问题。

6.RNase/DNase污染

RNase或DNase的污染很容易导致RNA/DNA降解,因此需要使用经RNase/DNase清洗的器皿和试剂,并在操作中避免污染。

7.温度控制:

RNA/DNA在高温下易于分解,因此在提取RNA/DNA时要控制好温度。在冷冻样品之前,通常建议在低温环境中培养细胞或收集组织,以极 大程度地保护RNA/DNA。

8.RNA/DNA保存:

RNA/DNA应该储存在-80℃冰箱中,以避免降解和污染。在长期储存之前,建议进行浓缩,并将RNA/DNA用RNase-free水稀释至合适的浓度。

9.质检:

在提取RNA/DNA之后,需要对其进行确定性和质量评估。可以使用分光光度计来测定RNA/DNA的浓度和质量,或者使用凝胶电泳来确认RNA/DNA的大小和纯度.


RNA/DNA提取的常见问题及解决方法:

1.RNA/DNA浓度低:

如果提取得到的RNA/DNA浓度较低,则可以通过浓缩RNA/DNA溶液或在提取过程中增加样品量来提高RNA/DNA的浓度。

2.RNA/DNA质量不佳:

如果RNA/DNA分离后质量不佳,则可能是由于RNase/DNase污染、过度破碎、过度处理等原因导致的。需要仔细检查每个步骤,并采取相应的措施来避免这些问题。

3.提取RNA或DNA有选择性:

有时,RNA或DNA的提取会出现选择性问题,即只能提取其中一种。这通常是由于使用的试剂或条件不适合同时提取RNA和DNA所导致的。可以尝试更换试剂或优化条件,以获得更好的RNA/DNA提取结果。

4.样品残留:

在提取RNA/DNA时,倒掉废液后可能会有样品残留在管子或器皿中。这可能会导致RNA/DNA的污染和降解,因此需要特别小心地清洁所有器皿和工具,确保没有任何残留物。

总之,在进行RNA/DNA提取时需要注意许多方面,并且可能会遇到一些问题。如果出现问题,需要仔细检查每个步骤并逐步解决问题,以确保最终得到高质量的RNA/DNA样本。


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