阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD），俗称“老年痴呆症”，是一种严重的神经退行性疾病，患者通常会出现以记忆力衰退、学习能力减弱为主的症状，并伴有情绪调节障碍以及运动能力丧失，极大地影响个人、家庭乃至社会的发展。目前，全球约有5000万人罹患AD。随着人类平均寿命增长、老龄化社会加剧，AD患病率也将不断上升，预计到2050年AD患者将增加至1.5亿以上。已有研究表明AD发病与代谢性改变相关，且AD具有很强的遗传性。目前仍缺乏预防或治疗AD的有效方法。组织及细胞相关的各类光学成像技术的应用有助于AD病理学特征检查、揭示病因机制，从而探索开发新的治疗策略。
以下将与大家分享徕卡THUNDER和MICA产品在研究AD星胶细胞功能障碍、易感基因机制中的应用。
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应用Leica Thunder Imager研究生物钟核心组分CLOCK和BMAL1蛋白在AD星形胶质细胞功能障碍中的作用机制
葡萄糖代谢的改变与AD的发病机制有关；星形胶质细胞有氧糖酵解是脑能量代谢的重要代谢途径；昼夜节律紊乱与阿尔茨海默病有关。本研究表明，AD患者大脑皮层受损星形胶质细胞中CLOCK和BMAL1蛋白水平显著升高。CLOCK和BMAL1的过表达通过降低人星形胶质细胞中己糖激酶1 (HK1)和乳酸脱氢酶A (LDHA)蛋白水平显著抑制有氧糖酵解和乳酸生成。此外，CLOCK和BMAL1的升高通过抑制胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在人星形胶质细胞中诱导功能损伤。此外，在人星形胶质细胞中，CLOCK和BMAL1的升高通过激活caspase-3依赖性凋亡来促进细胞毒性。
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样本
从荷兰脑库中获得3例AD患者的额叶皮质、枕叶皮质、颞叶皮质和顶叶皮质共12块石蜡包埋脑组织。从Novus Biologicals公司(Minneapolis, MN, USA)获得4个成人正常脑组织石蜡包埋块，包括额叶皮质(NBP2-77761)、枕叶皮质(NBP2-77766)、颞叶皮质(NBP2-77774)和顶叶皮质(NBP2-77769)。
02
免疫荧光分析
石蜡包埋组织块，制成4um厚度脑切片。切片在0.5% Triton-X (T8787, Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA))中渗透。在cas-block组化试剂(008120，Thermo Fisher)中封闭。然后用以下抗体染色:clock 1:100，(clock ab3517, Abcam， (Cambridge, UK))， bmal1 1:100，(NB100-2288, Novus Biologicals)，gfap 1:100，（#3670, Cell signaling technology）。二抗分别为山羊抗兔IgG (H+L) Alexa Fluor 488 (A11008, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)) 和山羊抗小鼠IgG H&L Texas Red (ab6787, Abcam (Cambridge, U.K.))，在25℃下作用2小时。使用DAPI，(F6057, Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)) 进行核染色。
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成像
THUNDER Imager Tissue (Leica Microsystems) 对染色脑切片成像。采用LAS X图像处理软件(Leica Microsystems )和ImageJ软件v1.52a (Bethesda, MD, USA)对染色脑切片进行定量。
图1所示：在脑皮质区受损的星形胶质细胞中，患者的CLOCK和BMAL1水平升高。
(A)大脑皮层中CLOCK表达的代表性免疫荧光图。AD或非AD的血管周围(V)星形胶质细胞标记GFAP(红色)中的CLOCK(绿色)表达 (每组n = 3，每个受试者n = 6)，DAPI标记细胞核（蓝色）。外表面(OS); 分子层 (ML); 外颗粒层 (EGL)。比例尺，20µm。(B)BMAL1在AD患者大脑皮层区域的表达 。血管周围星形胶质细胞标记物GFAP(红色)， BMAL1(绿色)在星形胶质细胞中表达(每组n = 3，每个受试者n = 6)。DAPI标记细胞核。C、D图为A、B的统计结果。
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应用Leica MICA 发现AD易感基因相关蛋白CD2AP存在于哺乳动物突触中，并调节突触的结构和功能
AD易感基因的果蝇同源物CD2相关蛋白 CD2AP是突触传递和蛋白质稳态的调节因子。缺乏CD2AP的小鼠存活至成年，行为正常，但血脑屏障完整性受损，导致对药物诱导癫痫发作的易感性增加。在来源于大鼠小脑颗粒神经元的原代培养中，Cd2AP敲低会破坏神经元的生长。对细胞培养、果蝇和小鼠模型的进一步研究也表明，CD2AP与淀粉样蛋白- β肽或tau蛋白之间可能存在相互作用，从而形成淀粉样斑块和神经原纤维缠结。
01
样本及免疫组化(IHC)：
培养神经细胞的免疫组化：
吸走培养基，用相同体积温的PFA 4% / 0.2M蔗糖/ 1 x PBS室温孵育10分钟，吸走，用相同体积的0.1% PBS-Triton孵育10分钟，PBS-T换成了PBS洗，在2%山羊血清中室温封闭1小时，然后在PBS + 1%山羊血清稀释的一抗中孵育，4℃过夜。随后PBS + 1%山羊血清中漂洗三次(室温下15分钟/次),在PBS + 1%山羊血清稀释的二抗中孵育2小时，清洗，用DAPI Fluoromount-G固定。
所用抗体：
兔抗cd2ap(IHC为1:2000，定制的多克隆抗体)；鸡抗map2(IHC为1:500 ,Abcam# ab5392)，小鼠抗neun (IHC为1:500,Sigma-Aldrich# MAB377)，小鼠抗psd95 (IHC为1:500，NeuroMab-UC Davis# 75-028)，豚鼠抗synapsin (IHC为1:250,Synaptic Systems# 106004)，分别与AlexaFluor 488、546、555和647荧光团结合(均为1:1000,Invitrogen)。
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成像
使用Leica LAS X和徕卡MICA，配备10 /0.32 NA(干)，20 /0.75 NA(干)，或63 /1.20 NA(水)物镜。所有免疫荧光图像使用Imaris 9.7.2或FIJI 2.1.0/1.53c进行处理。
图2. CD2AP染色在培养神经元中的定位。(A) CD2AP (绿色)与神经元标记物MAP2(洋红色)。(B) CD2AP (绿色)染色也与Synapsin(红色)。所有图像均为培养野生型 (WT) DIV14小鼠皮层神经元。
图3. CD2AP在小鼠星形胶质细胞中表达低。CD2AP (绿色)与星形胶质细胞标记物GFAP (红色)。细胞核 (DAPI，蓝色) 和MAP2(洋红色)也同时染色。所有图像均为野生型 (WT)培养的DIV14小鼠皮层神经元。
Thunder Imager以dute的zhuanliICC方法实时去除非焦面的模糊信号，在快速宽场成像的同时，获得高清高分辨图像。
MICA则以智能极简方式通过zhuanlifluosync技术能实现真正的同时四色成像，并提供最佳活细胞条件。
徕卡显微系统，见微知著，
我们与您一起探索未知的脑世界！
参考文献：
1. Elevated CLOCK and BMAL1 Contribute to the Impairment of Aerobic Glycolysis from Astrocytes in Alzheimer’s Disease. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7862.
2. Alzheimer’s disease risk gene CD2AP is a dose-sensitive determinant of synaptic structure and plasticity. Human Molecular Genetics, 2024, 1–18.
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