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脂质过氧化传感器检测原理、使用方法与注意事项

和元李记(上海)生物技术有限公 >> 进入商铺

2024/10/25 16:18:32

脂质过氧化是脂类的氧化降解过程,其主要由活性氧类(ROS)引发。脂质过氧化传感器(Lipid Peroxidation Sensor)是通过一种 C11-BODIPY 581/591 试剂的氧化来检测活细胞中的脂质过氧化情况。 C11 BODIPY 581/591 本质上是一种亲脂荧光染料,具有良好的光稳定性、低荧光伪影特质,能积累在膜内。 一旦染料的多不饱和丁间二烯基被氧化,荧光最大发射波长峰值从约 ∼590 nm 偏移至约 ∼510 nm,活细 胞的荧光从红色变为绿色,但仍维持亲脂性,从而反映膜的脂质过氧化水平。这种传感器通常用于荧光显 微镜和流式细胞分析中,可视化监测脂质 ROS 的生成和动态变化。

测定原理

LPO在酸性条件下加热,产生小分子终产物 MDA,MDA与TBA,生成红色产物,在 535nm有最大吸收峰。

使用方法

1. 流式细胞分析:

(1) 悬浮细胞:800 g 离心5 min 收集细胞沉淀;随后PBS 洗涤细胞两遍。

(2) 贴壁细胞:弃培养液,用常温PBS 或培养液轻洗细胞2 次,随后胰酶消化,800g 离心5 min 收集细胞沉淀,随后PBS 洗涤细胞两遍,每个样本收集1~5 ×105 个细胞。【注】:操作过程中轻柔吹打细胞,消化时间不宜过长,剧烈吹打或胰酶消化过度会影响实验结果。

(3) 脂质过氧化传感器用于脂质过氧化检测的推荐浓度为终浓度5μM;配制方法:用新鲜空白培养液配制终浓度为5μM 的脂质过氧化传感器染色液待用,DMSO 含量≤5‰。【注】:该步操作建议在消化细胞前准备好,以免细胞消化后久置影响实验结果。

(4) 将事先配置好的脂质过氧化染色液加入收集的细胞沉淀中,推荐体积为500μL,随后置于37℃孵箱,染色30min,期间5-10min 间隔轻弹细胞使其悬浮保证染色更充分。

(5) 染色结束后,800 g 离心5 min,弃上清,随后用PBS 清洗细胞2 次,加入200μLPBS 重悬细胞用于流式分析。

2. 原位成像:

(1) 接种适当密度的细胞于20mm 规格的盖玻片上(也可用共聚焦小皿替代),给予实验药物处理适当时

(1)间后,吸去培养液,用PBS 洗涤细胞一遍;加入500 μL 配制好的脂质过氧化染色液,于37℃染色30min;配制方法参考流式分析中的染色液配制。

(2) 弃培养液,PBS 洗涤细胞两遍后于荧光显微镜或激光共聚焦下进行成像检测。细胞在染色后应在1 h

(2)之内完成检测。

检测条件

该分子探针在还原状态下最佳激发波长为 581 nm, 发射为 591nm;被 Lipid ROS 氧化后最佳激发波长 为 500 nm,发射在 510nm。因此,在流式分析中检测通道为 FL1-A;激光共聚焦检测:氧化态激发波长可 选 488nm(FITC)通道;还原态激发波长可选 561 nm(TRITC)通道。

注意事项

1、临用前注意试剂二是否溶解,如未溶解,可以 70℃-90℃加热,并振荡以促进溶解。

2、使用前小心离心数秒取用,需佩戴手套操作,注意避免与皮肤、眼睛和黏膜接触。

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