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全蛋白的提取方法和注意事项

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2024/10/25 16:42:43

一、全蛋白的提取方法主要包括以下几种‌。

全蛋白的提取方法一:

  1. 细胞准备和清洗:首先,准备近乎长满的细胞,例如10cm大皿中的细胞。使用预冷的PBS清洗细胞1-2次,并弃去PBS。

全蛋白的提取方法二:

  1. 细胞裂解‌:加入适量的裂解液,如RIPA裂解液(强),并加入PMSF以抑制蛋白酶活性。如果需要提取磷酸化蛋白,还需加入磷酸酶抑制剂。裂解液配好后,将细胞在4℃下裂解15分钟。

全蛋白的提取方法三:

       超声破碎:将裂解后的细胞用超声波破碎仪处理1-2分钟,功率保持在20-30%,保持4℃。

全蛋白的提取方法四:

       离心‌:超声破碎后,将样品在4℃、12000rpm下离心15分钟。

全蛋白的提取方法五:

  1. 蛋白变性‌:吸取上清液至新的EP管中,加入适量的5x loading buffer,金属浴100℃加热10分钟使蛋白变性。

全蛋白的提取方法六:

  1. 存放‌:将变性后的蛋白存至-80℃冰箱‌。

  2. image.png

‌二、全蛋白提取的注意事项包括‌:

  1. 细胞状态和数量‌:确保细胞处于良好的生长状态,并在收集后尽快进行裂解,以避免蛋白质的降解和损失。

  2. 裂解条件‌:选择合适的裂解方法,避免对蛋白质的影响。注意控制温度、pH值和离子浓度等因素,以确保蛋白质的稳定性和可溶性。

  3. 离心条件‌:离心时需提前开离心机预冷,确保在4℃下进行,以避免蛋白质的变性。

  4. 蛋白变性‌:在加入loading buffer后,需充分加热使蛋白变性,确保蛋白电泳时的稳定性。

  5. 存放条件‌:将变性后的蛋白存放在-80℃冰箱中,以长期保存‌。

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