技术文章

在癌症免疫治疗时代，诸如PD-1单抗等的热门单靶点药物竞争已呈现状态，产品同质化严重，市场空间被严重挤压，且存在耐药性风险，以上问题刺激了对具有增强特异性和效力的双特异性抗体的研究。双特异性抗体（bsAb）是免疫疗法中快速发展的领域，作为下一代癌症治疗策略备受关注。BsAb是重组分子，旨在同时靶向两种不同的抗原或表位。这些抗体具有双重链和轻链组成的传统 Y 形结构，每个臂都有一个活性位点，可与不同的靶标结合。根据生物学靶点和作用方式，bsAb分为四大类（如Figure 1）：

Figure 1. The types of bispecific therapeutics in immuno-oncology.

BsAb作用机制在各种癌症的临床前和临床研究中取得了良好的疗效，目前，已有八款癌症免疫治疗bsAbs获得FDA/EMA 的批准（如Table 1）。

Table 1: Approved therapeutic bsAbs for cancer indications.

相比于传统单抗，bsAb在治疗方面更具潜在优势，包括：（1）介导免疫细胞对肿瘤的杀伤；（2）增强对免疫系统的激活作用；（3）双靶点信号阻断，防止耐药；（4）具备更强特异性、靶向性和低脱靶毒性；（5）介导更强的内吞作用。

BsAb 的功效、安全性和临床成功受其特性的影响，包括理化特性（大小、稳定性、结合亲和力和效价）、药代动力学 (PK)/药效学 (PD) 特性、可制造性和免疫原性等，bsAb的全面表征对于其设计和开发以及评估其功效和安全性至关重要，故需要从多方面并结合一系列技术来全面了解bsAb的特性以及驱动免疫系统靶向癌细胞的能力。在这里，我们介绍几种均相检测技术来表征靶向免疫检查点和肿瘤坏死因子 (TNF) 超家族的新型bsAb。

BsAb表征过程中的细胞因子研究的重要性

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（1）Evaluation of an anti-PD-1–GITR-L bispecific antibody

Chan等人研究了由抗PD-1抗体与抗GITR-L抗体融合组成的bsAb对免疫细胞活性的影响。作为研究的一部分，研究者进行了PBMC共刺激检测，以探究bsAb治疗对细胞因子释放的影响——将PBMC铺板并在抗CD3存在的情况下用不同稀释度的抗体进行处理。孵育48h和96h后，使用AlphaLISA®试剂盒检测收集的上清液中的IFN-γ和IL-2水平，并使用具有Alpha模块的酶标仪对结果进行定量。

结果显示，与单一治疗和1:1联合治疗相比，bsAb（抗 PD-1–GITR-L）治疗可诱导细胞因子的剂量依赖性增加（如Figure 2）。该数据不仅提供了关于bsAb如何影响免疫细胞行为的见解，还强调了与单一疗法和联合疗法的效果相比，抗PD-1-GITR-L双特异性抗体如何具有不同的作用机制。

Figure 2: Human PBMC co-stimulation assay following the indicated treatments in the presence of anti-CD3. Cells and supernatants were harvested/collected for assessment of (A) IL-2, (B) IFN-γ, and (C) IFN-γ secretion in autologous CD4+ T cell MLR.

Figure 3: Principle of the AlphaLISA technology

AlphaLISA是一种基于微珠的均相检测技术，AlphaLISA细胞因子测定使用两种针对目标细胞因子的特异性抗体。一种是生物素化的，与链霉亲和素包被的供体微珠结合，另一种则直接与受体微珠结合。在细胞因子存在的情况下，抗体与细胞因子结合，使供体和受体微珠靠近，当供体微珠激发后产生单线态氧进而激发受体微珠产生特异性信号，生成的AlphaLISA信号与样品中存在的细胞因子的量成正比关系。

（2）Evaluation of an anti-PD-L1–VEGF bispecific antibody

2021年上海复旦大学张雪梅团队开发了一种新型双特异性抗体HB0025，该抗体同时靶向PD-L1和VEGF。该bsAb是通过将VEGF受体1结构域(VEGFR1D2)与抗PD-L1 mAb融合而形成的。作为研究的一部分，研究人员通过测量细胞因子分泌水平来评估HB0025阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的能力。将PBMC与树突状细胞在96孔板中共培养，并接受HB0025、atezolizumab（一种PD-L1靶向抗体）、bevacizumab（一种VEGF靶向抗体）、阴性对照 (900543) 的处理。经过5天的孵育期后，使用HTRF技术检测上清液中IL-2的浓度。

结果显示，HB0025和atezolizumab均以剂量依赖性方式促进IL-2分泌增加，VEGF靶向抗体bevacizumab不会影响IL-2的分泌（如Figure 4）。该数据证明了HB0025的抗肿瘤作用，并表明新型双特异性抗体有效维持了其parent molecular的结合和阻断能力。

Figure 4: The dose-effect fitting curve of antibodies on the recovery of human IL-2 secretion, taking 900543 as the negative control.

Figure 5: Principle of the HTRF assay

HTRF是一种基于荧光基团的均相检测技术，该技术将荧光共振能量转移 (FRET) 技术与荧光时间分辨测量相结合（如Figure 5）。针对细胞因子检测，其中一个抗体标记了供体荧光基团，另一个抗体标记了受体荧光基团，当加入待分析物时，如果待分析物同时与两个抗体都结合，则供体荧光基团和受体荧光基团的距离被拉进，当激发供体荧光基团后，供体和受体之间产生FRET，进而激发受体荧光基团产生特异性信号，该信号与待分析物的浓度成正比关系。

BsAb表征过程中的杀伤作用的重要性

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Rajendran等人研究靶向CD30和CD137的bsAb是否可以增强基于抗体治疗霍奇金淋巴瘤（HRS）的特异性。该BsAb设计用于选择性结合CD30/CD137双阳性HRS细胞。为了测试bsAb的杀伤效率，研究者使用DELFIA® EuTDA试剂盒进行了ADCC测定。该项研究中，HRS细胞用DELFIA BATDA试剂标记，并与双特异性抗体和对照抗体一起接种到96孔板中，然后添加效应细胞（NK细胞）并孵育3h。该测定的读数基于使用多功能酶标仪测量的荧光值，测量的信号值与裂解细胞的数量直接相关。

结果表明，与对照抗体相比，使用两个bsAb clone进行处理可使双阳性 (CD30+ CD137+) 细胞的杀伤率增加约4倍（如Figure 6）。此外，与自发裂解水平相比，这些clone对单阳性细胞的杀伤效率相当。这表明bsAb对双阳性细胞的选择特异性，突出了bsAb触发针对特定细胞群的ADCC潜力。

Figure 6: ADCC activity of bispecific antibodies.

HL cells were labeled with 1 μl/ml of BATDA reagent and treated with 5μg/ml of bispecific antibodies (137A-30A, 137A-30B) or human IgG(Isotype) for 40min at 4°C. Effector NK cells were added at E:T of 20:1 and incubated for more than 3 hours. Means ± SD of fold killing are represented (**p<0.01). Data are representative of three independent experiments.

Figure 7: DELFIA EuTDA Cytotoxicity Assay for ADCC Determination.

DELFIA Eu TDA检测法是一种非放射性的细胞杀伤检测方法，具有标记特异性，高灵敏度，可操作性，安全性，稳定性等优点。如Figure 7，靶细胞与BATDA进行孵育标记，然后与抗体结合，并与免疫效应细胞共培养。抗体与靶细胞表面的抗原结合，而效应细胞与抗体的Fc区结合，与靶细胞形成复合物。复合物的形成会激活免疫效应细胞，从而对靶细胞进行细胞裂解，细胞裂解后TDA被释放到上清液中。将上清液转移至新的检测板中，并添加Eu3+ solution以形成EuTDA螯合物，使用兼容时间分辨荧光（TRF）的酶标仪进行读值（设置检测信号在340nm处激发，在615nm处发射）。

小结

双特异性抗体的成功在于其能够克服当前免疫疗法的局限性，并提高疗效和安全性。尽管目前获批的bsAb产品不多，但随着血友病领域双特异性抗体 Emicizumab的成功上市，并在5年间成为年销售额33亿美元的全球重磅药物，引发了一波双特异性抗体研发热潮。

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