技术文章

仅供科研使用，不得用于临床诊断

皮质酮;肾上腺酮（CORT）定量检测试剂盒（ELISA）

定量检测血清、血浆、细胞培养上清液中皮质酮;肾上腺酮（CORT）的浓度。

使用试剂盒前，必须仔细阅读本说明书。

实验原理

本试剂盒采用竞争法酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被抗皮质酮;肾上腺酮（CORT）抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入皮质酮;肾上腺酮（CORT）校准品和待测样本，再加入HRP标记的皮质酮;肾上腺酮（CORT）抗原（酶标抗原），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体-酶标抗原的免疫复合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M 硫酸）作用下，最终转化为黄色，在酶标仪450nm波长上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中皮质酮;肾上腺酮（CORT）的浓度负相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中皮质酮;肾上腺酮（CORT）的浓度。

试剂盒限制性

1、 仅供科研使用，不得用于临床诊断。

2、 在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品不得使用。

3、 跟其他厂家的试剂盒或者组分不能混用。

4、 使用试剂盒配套的样品稀释液。

5、 如果样本值高于最高标准品浓度值，请将样本适当稀释后，再重新测定。

6、 待测样本中存在的人抗鼠等异嗜抗体会干扰检测结果，检测前，请排出该因素。

7、 通过其他方法得到的检测结果，与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。

技术提示

1、 混合蛋白溶液时，避免起泡。

2、 加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分应该悬臂加样，避免交叉污染。

3、 合适的温育时间，和充分的洗涤步骤，是保证实验结果准确性的必要条件。

4、 使用自动洗板机时，加入一个30秒浸泡的步骤，可以提高检测精度。

5、 底物溶液为无色液体，保存过程中变为蓝色，代表底物溶液已经失效，不得使用。

6、 终止液加样顺序与底物溶液加样顺序一致，加入终止液后，蓝色底物产物，会瞬间变为黄色。

7、 实验中，用剩的板条，应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

8、 所有液体组分，使用前充分摇匀，严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。

试剂盒组分与保存

未开封的试剂盒保存在2-8度，不得使用过期试剂盒。

标准品浓度依次为：1600、800、400、200、100、0 pg/mL.

其他用品

1、 酶标仪（450nm）

2、 精密移液器及一次性吸头

3、 蒸馏水

4、 洗瓶或者自动洗板机

5、 37℃水浴锅或恒温箱

6、 500ml量筒

生物安全

1、 检测必须符合实验室管理规范的规定，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置。

2、 试剂盒的液体组分中，含有proclin-300防腐剂，可能引起皮肤过敏反应，避免吸入烟雾与皮肤接触。

3、 底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入烟雾。

4、 戴上防护手套，实验完成后洗手。

样品的采集和储存

以下只是列出样品采集和保存的一般指南。所有样本采集保存过程中，不得使用叠氮钠做为防腐剂。

1、 细胞培养上清：4000rpm条件下离心20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反复冻融。

2、 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4000rpm条件下离心20min，小心地分离出血清，保存在-20℃以下，避免反复冻融。

3、 血浆：肝素，EDTA，或柠檬酸钠作为抗凝剂。在4000rpm条件下，离心20分钟取上清，血浆保存在-20℃以下，避免反复冻融。

样本收集后，无法一次检测完毕，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分解冻。

4、 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1: 9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9 mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎或反复冻融。最后将匀浆液5000×g离心 5-10分钟，取上清检测。

5、 细胞提取液：贴壁细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5分钟后收集细胞；悬浮细 胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每 1×106 个细胞中加入150-200μLPBS重悬并通过反复冻融使细胞破碎(若含量很低可减少PBS的体积)。将提取液于1500×g离心10分钟，取上清检测。  

6、 其他生物体液：1000×g 离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

试剂准备

1、 使用前，所有的组分都要至少复温60min，确保充分复温到室温。

2、 浓缩洗涤液：从冰箱取出的浓缩洗涤液，会有结晶产生，这属于正常现象，水浴加热使结晶溶解。浓缩洗涤液与蒸馏水，按1:20稀释，即1份的浓缩洗涤液，添加19份的蒸馏水。

3、 底物：底物液A和B，在使用前，按1:1体积充分混合，混合后15分钟内使用。

操作程序

所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。

1、 按前面说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。

2、 从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。

设置标准品孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，空白孔不加，样本孔加待测样本50μL。

3、除空白孔外，标准品孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗原100μL。

4、 用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5、 揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置20S，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复5次。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。

6、 将底物A和B按1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育15min。

7、 所有孔加入终止液50μL，在酶标仪上读取各孔吸光度（OD值）。

结果计算

1、 以标准品浓度做为横坐标，对应的吸光度（OD值）作为纵坐标，利用计算机软件，采用四参数Logistic曲线拟合（4-pl），创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD值），利用方程计算样品的浓度值。

2、 如果样品被稀释，通过上述方法测的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的最终浓度。

试剂盒性能指标

1、物理性能

试剂盒的各液体组分应澄清透明、无沉淀或者絮状物。微孔板铝箔袋应真空包装，无破损漏气。

2、剂量反应曲线线性

校准品剂量反应曲线相关系数r值，大于等于0.9900。

3、精密度

批内精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在同一个板块内精度评估。批内变异系数CV%小于10%。

批间精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在不同板块内精度评估。批间变异系数CV%小于15%。

4、灵敏度

检出剂量小于10 pg/mL。

5、回收率

三组已知的高、中、低浓度样品，进行五次在同一个板块内回收率评估，回收率在85%-115%之间。

6、特异性

本试剂盒识别天然和重组皮质酮;肾上腺酮（CORT），与结构类似物无交叉。

7、稳定性

2℃-8℃保存，有效期6个月。

8、 检测范围

50 pg/mL - 1600 pg/mL