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超声微泡在肿瘤细胞报告基因转染的潜力探索

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2024/11/4 18:14:48

一、引言

肿瘤是当今世界严重威胁人类健康的重大疾病之一,传统的治疗方法如手术、化疗和放疗在一定程度上改善了患者的预后,但仍存在局限性。基因治疗作为一种新兴的治疗策略,为肿瘤治疗带来了新的希望。然而,基因转染效率和靶向性一直是制约其发展的关键问题。

超声微泡技术作为一种新型的非病毒基因转染方法,具有更好的优势。超声微泡是一种微小的气泡结构,其外壳通常由生物相容性材料构成,内部填充气体。在超声场的作用下,微泡能够产生一系列的物理效应,如空化效应、声流效应等。这些效应可以使细胞膜通透性增加,从而促进基因进入细胞。此外,超声微泡还可以通过表面修饰实现对肿瘤细胞的靶向性,减少对正常细胞的影响。因此,探索超声微泡在肿瘤细胞报告基因转染中的潜力对于肿瘤基因治疗的发展具有重要意义。

二、材料与方法

(一)材料

细胞系

选用多种常见的肿瘤细胞系,如人乳腺癌细胞系 MCF - 7、人肺癌细胞系 A549、人肝癌细胞系 HepG2 等,这些细胞系均购自正规细胞库,并在含 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 链霉素的相应培养基中,于 37°C、5% CO₂ 的培养箱中培养。

试剂

报告基因质粒(如绿色荧光蛋白 GFP 基因质粒)、脂质体、聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物(PLGA)、全氟丙烷气体、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、荧光定量 PCR 试剂盒、Western blotting 相关试剂等。

仪器

超声发生器(频率、功率可调)、荧光显微镜、流式细胞仪、实时荧光定量 PCR 仪、离心机、细胞培养箱等。

(二)超声微泡的制备

脂质微泡的制备

采用薄膜水化法制备脂质微泡。将磷脂(如二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇等)按一定比例溶解于氯仿中,旋转蒸发形成均匀的脂质薄膜。然后,加入含有报告基因质粒的缓冲液,水化后得到脂质 - 基因复合物溶液。将溶液置于超声发生器下,在一定功率和频率下超声处理一定时间,使脂质形成微泡结构,并将基因包裹于微泡内或吸附于微泡表面。

PLGA 微泡的制备

以 PLGA 为材料,采用双乳液 - 溶剂挥发法制备微泡。首先,将报告基因质粒溶解于内水相中,将 PLGA 溶解于有机溶剂(如二氯甲烷)中,形成油相。将内水相和油相混合,通过超声乳化形成初乳。然后,将初乳加入到含有表面活性剂的外水相中,再次超声乳化形成双乳液。在搅拌条件下,有机溶剂挥发,形成 PLGA 微泡,离心洗涤后备用。

(三)肿瘤细胞模型的建立

将培养至对数生长期的肿瘤细胞消化后,以适当的密度接种于细胞培养板(如 6 孔板、24 孔板等)或培养皿中,继续培养至细胞贴壁并达到一定的汇合度(如 70% - 80%),形成肿瘤细胞模型,用于后续的转染实验。

(四)超声微泡介导的肿瘤细胞转染实验

转染分组

设置不同的转染组,包括超声微泡 + 报告基因组、单纯报告基因组(阳性对照,如脂质体转染报告基因)、阴性对照组(仅细胞,不加转染试剂和基因)等,每组设置多个复孔,以保证实验结果的准确性。

转染操作

对于超声微泡 + 报告基因组,将制备好的超声微泡悬液(含报告基因)加入到肿瘤细胞培养体系中,然后将细胞培养板置于超声发生器的探头下,调整超声参数(如频率、功率、辐照时间等)进行超声处理。超声处理后,继续培养细胞一定时间(如 24 - 48 小时)。对于阳性对照组,按照脂质体转染试剂的说明书进行报告基因的转染操作。

(五)转染效率的评估

荧光显微镜观察

在转染后的不同时间点(如 24、48 小时),使用荧光显微镜观察肿瘤细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。计算荧光阳性细胞的比例,初步评估转染效率。

流式细胞术分析

收集转染后的肿瘤细胞,用胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液,通过流式细胞仪检测荧光强度。根据荧光阳性细胞的比例和平均荧光强度,精确评估转染效率。

(六)细胞活力检测

采用细胞计数试剂盒(CCK - 8)法检测转染后肿瘤细胞的活力。在转染后的不同时间点,向细胞培养孔中加入 CCK - 8 试剂,继续培养一定时间后,使用酶标仪检测 450nm 处的吸光度值。根据吸光度值计算细胞活力,评估超声微泡转染对细胞活性的影响。

(七)基因表达水平检测

实时荧光定量 PCR

提取转染后肿瘤细胞的总 RNA,反转录为 cDNA。使用特异性引物对报告基因进行实时荧光定量 PCR 分析,以 β - actin 等管家基因作为内参,计算报告基因的相对表达量,评估基因转录水平的变化。

Western blotting

提取转染后肿瘤细胞的总蛋白,通过 SDS - PAGE 电泳分离蛋白,转膜后用特异性抗体(如抗 GFP 抗体)进行免疫印迹分析。使用化学发光试剂显色,通过凝胶成像系统分析蛋白条带的灰度值,以评估报告基因在蛋白表达水平的变化。

(八)转染条件的优化

通过改变超声参数(如频率从 1MHz 到 3MHz、功率从 0.5W/cm² 到 2W/cm²、辐照时间从 10s 到 60s)、微泡浓度、报告基因质粒浓度等因素,重复上述转染实验和检测方法,观察转染效率、细胞活力和基因表达水平的变化,以确定最佳的转染条件。

三、结果

(一)超声微泡的表征

通过光学显微镜和粒径分析仪对制备的超声微泡进行观察和测量,结果显示脂质微泡和 PLGA 微泡具有良好的球形度和较窄的粒径分布,平均粒径在 1 - 5μm 之间,符合在体内外应用的要求。同时,通过琼脂糖凝胶电泳等方法证实报告基因质粒成功包裹于微泡内或吸附于微泡表面。

(二)转染效率评估

荧光显微镜观察结果

在荧光显微镜下,超声微泡 + 报告基因组在转染后 24 小时即可观察到部分肿瘤细胞呈现绿色荧光,随着时间的延长,荧光阳性细胞数量逐渐增加。在 48 小时时,不同肿瘤细胞系中的荧光阳性细胞比例有所不同,但均明显高于阴性对照组。

流式细胞术分析结果

流式细胞术检测结果进一步定量证实了超声微泡介导的转染效率。与阳性对照组(脂质体转染)相比,超声微泡在某些肿瘤细胞系(如 MCF - 7)中的转染效率相近,而在其他细胞系(如 A549)中虽略低于阳性对照组,但仍具有较高的转染效率。

(三)细胞活力检测结果

CCK - 8 法检测结果显示,超声微泡转染后的肿瘤细胞活力在转染后 24 - 48 小时内保持在较高水平,与阴性对照组相比无显著差异。这表明超声微泡转染方法对肿瘤细胞的活性影响较小,具有较好的生物安全性。

(四)基因表达水平检测结果

实时荧光定量 PCR 结果

实时荧光定量 PCR 分析表明,超声微泡 + 报告基因组中报告基因的 mRNA 表达量在转染后明显增加,与阴性对照组相比有显著差异,且在优化转染条件后,表达量进一步提高。

Western blotting 结果

Western blotting 结果显示,在超声微泡转染后,肿瘤细胞中报告基因编码的蛋白表达水平与 mRNA 表达水平变化趋势一致,证实了超声微泡能够有效促进报告基因在肿瘤细胞中的表达。

(五)转染条件优化结果

通过对超声参数、微泡浓度、报告基因质粒浓度等因素的优化,发现当超声频率为 2MHz、功率为 1.5W/cm²、辐照时间为 30s、微泡浓度为 [具体浓度]、报告基因质粒浓度为 [具体浓度] 时,在大多数肿瘤细胞系中可以获得最佳的转染效率,同时保持较高的细胞活力。

四、讨论

(一)超声微泡技术的优势与局限性

超声微泡技术在肿瘤细胞报告基因转染中表现出了明显的优势。其非病毒载体的特性避免了病毒载体可能带来的免疫原性和潜在的致病性问题。超声微泡的靶向性修饰潜力为肿瘤特异性治疗提供了可能。然而,本研究也发现该技术存在一定的局限性,如转染效率在某些细胞系中仍有待提高,超声参数的优化需要针对不同的细胞类型进行个体化调整等。

(二)超声微泡的物理效应与转染机制

超声微泡在超声场作用下产生的空化效应和声流效应是促进基因转染的关键物理机制。空化效应能够使细胞膜产生可逆或不可逆的小孔,增加细胞膜的通透性,从而有利于基因进入细胞。声流效应则可以促进微泡周围的基因向细胞膜附近的运输,提高基因与细胞膜的接触机会。但这些物理效应的强度和作用方式受到超声参数的严格调控,不当的参数可能导致细胞损伤。

(三)不同类型超声微泡的比较

本研究中制备的脂质微泡和 PLGA 微泡在转染性能上各有特点。脂质微泡具有较好的生物相容性和易于制备的优点,但其稳定性相对较差。PLGA 微泡则具有较好的稳定性,但在基因包封率和释放效率方面可能需要进一步优化。未来可以考虑结合两者的优点,开发新型的复合微泡用于肿瘤细胞转染。

(四)对肿瘤基因治疗的启示

本研究结果为肿瘤基因治疗提供了重要的实验依据。超声微泡技术有望成为一种有效的肿瘤基因转染方法,可用于将治疗性基因导入肿瘤细胞。通过进一步优化转染条件和微泡设计,提高转染效率和靶向性,有望实现更精准、更有效的肿瘤基因治疗。

五、结论

综上所述,超声微泡在肿瘤细胞报告基因转染中展现出了巨大的潜力。通过合理的超声微泡制备、优化转染条件和对转染效率、细胞活力及基因表达水平的全面评估,证实了该技术在肿瘤基因治疗领域的可行性和应用前景。然而,仍需要进一步深入研究以克服其目前存在的局限性,推动超声微泡技术在肿瘤治疗中的临床应用。


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