一、引言
毛白杨作为我国重要的造林树种之一，在木材生产、生态防护等方面有着广泛的应用。然而，随着环境变化和林业发展的需求，提高毛白杨的抗逆性和生长质量成为研究的重点。多胺合成途径在植物的生长发育和应对环境胁迫中起着至关重要的作用，而 MdSPDS1 基因作为多胺合成途径中的关键基因，在其他植物中的研究已显示出其对植物生理特性的重要影响。在毛白杨中引入 MdSPDS1 基因，有望改变毛白杨的多胺代谢水平，进而影响其生长和抗逆能力。本研究旨在深入探究 MdSPDS1 基因对毛白杨遗传转化的作用机制，为毛白杨的遗传改良提供新的途径。
二、材料与方法
（一）植物材料
采集健康的毛白杨幼嫩叶片和茎段作为外植体，来源于生长良好的毛白杨植株，种植于实验基地，确保材料的一致性和遗传稳定性。
（二）菌株与载体
大肠杆菌 DH5α 菌株用于基因克隆，农杆菌 LBA4404 菌株用于遗传转化。构建含有 MdSPDS1 基因的植物表达载体，载体带有合适的启动子（如 CaMV 35S 启动子）和筛选标记基因（如卡那霉素抗性基因）。
（三）基因克隆
总 RNA 提取
采用改进的 CTAB 法从苹果组织（含有 MdSPDS1 基因）中提取总 RNA。将提取的 RNA 用 DNase I 处理以去除残留的 DNA，然后通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测 RNA 的质量和浓度，确保 RNA 的完整性和纯度。
cDNA 合成
使用反转录试剂盒，以提取的高质量 RNA 为模板，合成第一链 cDNA。反应体系包括 RNA、反转录引物、dNTPs、反转录酶等，按照试剂盒说明书在合适的温度条件下进行反应。
目的基因扩增
根据已知的 MdSPDS1 基因序列设计特异性引物，引物两端添加合适的酶切位点。以合成的 cDNA 为模板，利用高保真 DNA 聚合酶进行 PCR 扩增。PCR 反应条件为：94℃预变性 5 分钟；94℃变性 30 秒，55 - 60℃退火 30 秒，72℃延伸 1 - 2 分钟（根据目的基因长度调整延伸时间），共 30 - 35 个循环；最后 72℃延伸 10 分钟。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，回收目的条带。
（四）植物表达载体构建
将回收的 MdSPDS1 基因片段和植物表达载体分别用相应的限制性内切酶进行双酶切，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳再次分离，然后使用 DNA 连接酶将目的基因片段与线性化的载体在合适的温度下连接过夜。连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性平板筛选阳性克隆。提取重组质粒，进行酶切鉴定和测序验证，确保目的基因正确插入载体且序列无误。
（五）毛白杨遗传转化
外植体预处理
将采集的毛白杨幼嫩叶片和茎段用流水冲洗 30 分钟，然后在 70% 酒精中浸泡 30 - 60 秒，再用含有几滴吐温 - 20 的 0.1% 溶液消毒 8 - 10 分钟，最后用无菌水冲洗 5 - 6 次，备用。
农杆菌介导的转化
将含有重组质粒的农杆菌 LBA4404 菌株在含有相应抗生素的液体培养基中过夜培养，至对数生长期。取适量菌液离心，用液体共培养培养基重悬农杆菌，使菌液 OD600 值在 0.5 - 0.8 之间。将预处理后的毛白杨外植体放入农杆菌菌液中浸泡 10 - 15 分钟，期间不断轻轻摇动。然后将外植体转移至共培养培养基上，在黑暗条件下共培养 2 - 3 天。
筛选与再生培养
共培养结束后，将外植体用无菌水冲洗 3 - 4 次，以去除表面残留的农杆菌。然后将外植体转移至含有卡那霉素（筛选压力根据预实验确定）和头孢噻肟钠（抑制农杆菌生长）的筛选培养基上进行筛选培养。每隔 2 - 3 周将外植体转移至新的筛选培养基，直到长出抗性芽。将抗性芽切下，转移至生根培养基中诱导生根，获得再生植株。
（六）转基因毛白杨的检测
PCR 检测
提取转基因毛白杨植株的基因组 DNA，以非转基因毛白杨基因组 DNA 为对照，利用 MdSPDS1 基因特异性引物进行 PCR 检测。PCR 反应条件和程序与基因克隆中的相同。通过琼脂糖凝胶电泳观察是否有目的基因条带，初步判断植株是否为转基因植株。
Southern 杂交检测
对 PCR 检测阳性的植株进一步进行 Southern 杂交检测。提取基因组 DNA，用合适的限制性内切酶进行酶切，然后将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，转膜至尼龙膜上。制备 MdSPDS1 基因探针，通过标记（如放射性标记或标记）后与尼龙膜上的 DNA 进行杂交。经过洗膜、显色等步骤，观察杂交信号，确定 MdSPDS1 基因在毛白杨基因组中的拷贝数。
Northern 杂交检测
提取转基因毛白杨和对照植株的总 RNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离，转膜至尼龙膜上。制备 MdSPDS1 基因的 RNA 探针，与尼龙膜上的 RNA 进行杂交，检测 MdSPDS1 基因在转基因毛白杨中的转录水平。
Western 杂交检测
提取转基因毛白杨和对照植株的总蛋白，通过 SDS - PAGE 电泳分离，转膜至 PVDF 膜上。使用 MdSPDS1 基因编码蛋白的特异性抗体进行 Western 杂交检测，通过显色反应观察蛋白表达情况，确定 MdSPDS1 基因在转基因毛白杨中的翻译水平。
（七）生理生化指标测定
多胺含量测定
采用高效液相色谱法（HPLC）测定转基因毛白杨和对照植株不同组织（如叶片、茎、根）中的多胺含量。将植物组织样品在液氮中研磨成粉末，加入提取液提取多胺，经过衍生化处理后，用 HPLC 进行分析，比较转基因植株和对照植株多胺水平的变化。
生长指标测定
测量转基因毛白杨和对照植株的株高、茎粗、叶面积等生长指标。定期记录植株的生长情况，从幼苗期到成熟期进行连续观察和测量，分析 MdSPDS1 基因对毛白杨生长的影响。
抗逆性指标测定
在模拟不同环境胁迫条件（如干旱、盐胁迫）下，测定转基因毛白杨和对照植株的相关抗逆性指标。例如，在干旱胁迫下，测定叶片相对含水量、脯氨酸含量、抗氧化酶活性（如超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶）等；在盐胁迫下，测定叶片的钠离子和氯离子含量、膜透性等，评估 MdSPDS1 基因对毛白杨抗逆能力的影响。
三、结果
（一）基因克隆与载体构建
成功从苹果组织中克隆出 MdSPDS1 基因，扩增产物大小与预期相符。构建的植物表达载体经酶切鉴定和测序验证，表明 MdSPDS1 基因已正确插入载体。
（二）毛白杨遗传转化与检测
经过农杆菌介导的遗传转化和筛选培养，获得了一批抗性植株。PCR 检测结果显示，部分植株扩增出目的基因条带。Southern 杂交检测进一步确定了 MdSPDS1 基因在转基因毛白杨基因组中的整合情况，包括拷贝数。Northern 杂交和 Western 杂交结果表明，MdSPDS1 基因在转基因植株中能够正常转录和翻译。
（三）生理生化指标变化
多胺含量
HPLC 分析结果显示，转基因毛白杨植株不同组织中的多胺含量与对照植株相比有显著变化，表明 MdSPDS1 基因的导入改变了毛白杨的多胺代谢水平。
生长指标
转基因毛白杨在株高、茎粗和叶面积等生长指标上与对照植株存在差异，整体表现出更好的生长态势，说明 MdSPDS1 基因对毛白杨生长有促进作用。
抗逆性指标
在干旱和盐胁迫条件下，转基因毛白杨的叶片相对含水量、脯氨酸含量、抗氧化酶活性等抗逆性指标表现优于对照植株，叶片的钠离子和氯离子含量、膜透性等指标也显示出转基因植株具有更强的抗逆能力，表明 MdSPDS1 基因提高了毛白杨的抗逆性。
四、讨论
（一）MdSPDS1 基因在毛白杨中的功能
本研究结果表明，MdSPDS1 基因在毛白杨中能够正常表达并发挥作用。其对多胺代谢的调控影响了毛白杨的生长和抗逆能力。多胺作为一类具有广泛生理功能的小分子物质，可能通过参与细胞分裂、伸长、膜稳定等过程来促进毛白杨的生长。在抗逆方面，多胺可能与抗氧化系统相互作用，调节细胞内的离子平衡和渗透平衡，从而增强毛白杨对干旱和盐胁迫的耐受性。
（二）遗传转化效率及影响因素
在毛白杨遗传转化过程中，外植体的类型、农杆菌菌株、共培养条件等因素都会影响转化效率。本研究中，幼嫩叶片和茎段作为外植体在合适的共培养条件下获得了一定的转化效率，但仍有提升空间。进一步优化这些因素，如筛选更合适的农杆菌菌株或改进共培养方法，有望提高转化效率，为大规模的毛白杨遗传改良提供更好的技术支持。
（三）与其他基因的相互作用
在毛白杨的生长发育和抗逆过程中，MdSPDS1 基因可能与其他基因存在相互作用。例如，多胺代谢途径中的其他基因以及与抗逆相关的信号转导途径中的基因可能共同参与了对环境胁迫的响应。未来的研究可以通过转录组学、蛋白质组学等手段深入探究 MdSPDS1 基因与其他基因的互作网络，进一步揭示其在毛白杨中的作用机制。
五、结论
本研究成功将 MdSPDS1 基因导入毛白杨，并通过多种检测手段证实了基因的整合、转录和翻译。生理生化指标分析表明，MdSPDS1 基因显著改变了毛白杨的多胺含量，促进了毛白杨的生长并提高了其抗逆能力。这为利用 MdSPDS1 基因进行毛白杨的遗传改良提供了有力的证据，同时也为进一步研究多胺代谢与植物生长发育和抗逆性的关系提供了新的视角。未来的研究可在优化遗传转化体系和深入探究基因互作等方面展开，以更好地发挥 MdSPDS1 基因在毛白杨遗传改良中的潜力。
