技术文章

各类染料在实验室中非常常用！本期我们将为大家介绍 PKH 26，一种用于体外细胞标记和追踪的优质染料！让我们结合实际案例，看看科研大佬们是如何利用 PKH 26 进行细胞研究的~

本期要和大家分享的是我们的客户文献: “Gouqi-derived nanovesicles (GqDNVs) inhibited dexamethasone-induced muscle atrophy associating with AMPK/SIRT1/PGC1α signaling pathway” (枸杞衍生的纳米囊泡在对抗肌肉萎-缩中的作用) 这项创新研究发表在 J Nanobiotechnology (IF=10.42)。

该文献使用了 PKH 26 (MedChemExpress) 进行研究，这是一种红色荧光染料，已被证明对体外细胞标记和追踪非常有用。

在这项研究中，研究人员成功追踪了 C2C12 细胞中 GqDNVs 的细胞摄取，证明了染料能够清晰地可视化细胞过程。结果显示摄取率为 56%，并强调了 GqDNVs 在改善肌肉功能方面的作用。


01
案例分享：J Nanobiotechnology

 背景介绍：

• 随着全-球老龄化趋势加剧，肌肉减少症已成为重大的公共卫生问题。肌肉减少症是一种进行性、广泛性的骨骼肌疾病，是指随着年龄增长而导致的骨骼肌质量和功能的损失。

• 枸杞，在中国又称为“枸杞子”，是一种传统中药，可以增强肌肉和骨骼的结构和功能。此外，先前的研究表明，植物衍生的外泌体类纳米颗粒可以在不同的衰老或疾病模型中发挥良好的生物活性作用。

• 该研究探索了枸杞衍生纳米囊泡 (GqDNV) 在对抗与年龄相关的肌肉萎-缩方面的潜力。作者成功利用 PKH 26 (红色荧光，MedChemExpress) 染料推进研究，并取得了显著成果！  

提取 GqDNV

首先，采用超速离心和密度梯度离心相结合的方法，从新鲜枸杞 (宁杞 7 号) 中提取 GqDNV (图 1)。

其次，通过 NTA (Nanoparticle tracking analysi, 纳米颗粒跟踪分析) 和透射电子显微镜观察发现 GqDNV 为细胞外囊泡，呈“杯盘”状，大小为 127.8±1.3 nm (图 2)。

图 2. GqDNVs 的的透射电镜图^[1]。

此外，研究人员还利用 C2C12 细胞，测试了 C2C12 细胞中的细胞活力、ATP和线粒体膜电位。

02
他们如何利用 PKH 26 进行细胞研究？

PKH 26 是一种红色荧光染料，可与细胞膜的脂质区域结合。它能够发出红色荧光 (Ex/Em=551/567 nm)，因此成为体外细胞标记和追踪研究的重要工具。

在细胞摄取试验中，他们使用 PKH 26 (红色荧光，MedChemExpress) 跟踪 GqDNV 的细胞内吞过程。此外，C2C12 细胞的细胞骨架用异硫氰酸荧光素 (FITC) 鬼笔环肽 (Phalloidin) (绿色荧光) 显示，细胞核用 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) (蓝色荧光) 标记。同时，还使用流式细胞荧光分选技术 (Fluorescence activated Cell Sorting, FACS) 来测量 C2C12 细胞摄取 PKH 26 标记的 GqDNV 的数量。  

PKH 26 跟踪 GqDNV 的细胞内吞过程

(1) GqDNVs 用 PKH 26（红色荧光，MedChemExpress）标记。

(2) 将 PKH 26 溶解于二甲基亚砜 (Dimethyl sulfoxide, DMSO) 中，得到 1 mM PKH 26 储备溶液。用 PBS 以 1:100 稀释储备溶液，得到 10 μM 工作溶液。

(3) 将 GqDNVs 与工作溶液在室温下孵育 30 min，然后在 150,000×g下超速离心 1.5 h，得到 PKH 26 标记的 GqDNVs。

(4) 将 PKH 26 标记的 GqDNVs 与 C2C12 细胞在 37 °C 黑暗条件下孵育 6 h。孵育后，收获细胞并用 PBS 清洗以去除游离颗粒。 

(5) C2C12 细胞的细胞骨架用异硫氰酸荧光素 (FITC) 鬼笔环肽 (Phalloidin) (绿色荧光) 标记，细胞核用 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) (蓝色荧光) 标记。这些染料能够有效准确地追踪 GqDNV 的细胞内吞过程。
(6) 通过点扫描激光共聚焦 (FV3000) 观察 C2C12 细胞对 GqDNVs 的内吞作用。
实验结果

将 PKH 26 染色的 GqDNV与 C2C12 细胞共培养 6 h 后，研究人员通过荧光共聚焦显微镜观察到 GqDNV 被 C2C12 细胞摄取 (图 3)。表明 GqDNVs 可被 C2C12 细胞吸收。 

图 3. C2C12 细胞和 GqDNVs 的荧光共聚焦显微镜图^[1]。

PKH 26 标记 GqDNVs (红色荧光)；FITC 染色 C2C12 细胞骨架 (绿色荧光)；DAPI 染色 C2C12 细胞核 (蓝色荧光)；合并图是三个荧光图像的重合图。

FACS 测量 ：C2C12 细胞摄取 PKH 26 标记的 GqDNVs 的数量

(1) 将 C2C12 细胞接种在含有 2 mL 培养基的 6 孔板中，分为三组 (空白组、阳性组和 GqDNVs)。

(2) 将 C2C12 细胞在空白组 (PBS)、阳性组 (10 μM PKH 26) 和 GqDNVs 组 (PKH 26 标记的 GqDNVs) 中孵育 6 h。

(3) 使用全光谱分析流式细胞术 (ID 7000) 测量具有阳性荧光的 C2C12 细胞的数量。

实验结果

流式细胞荧光分选技术（FACS）显示荧光阳性的 C2C12 细胞数量为 56％ (图 4)。

图 4. FACS 分选后 PKH 26 标记的 GqDNVs 处理的 C2C12 细胞中荧光阳性细胞数量的代表^[1]。

a：PBS 处理的 C2C12 细胞 (空白组)。b：PKH 26 标记的 C2C12 细胞 (阳性组)。c：PKH 26 标记的 GqDNVs 处理的 C2C12 细胞 (GqDNVs 组)。a-c：纵坐标 (Events) 上的数字表示细胞数。横坐标显示荧光强度。图上的百分比表示荧光阳性的 C2C12 细胞占总细胞数的百分比。

该研究的其他主要发现：

• GqDNVs 可以促进 Dexamethasone 给药的 C2C12 细胞中肌管的直径。

• GqDNV 影响肌肉中成肌因子 5 (MYF5)、肌生成素 (MYOG) 和成肌分化 (MYOD) 蛋白的表达水平，这与 AMPK/SIRT1/PGC1α 通路相关。

• 本研究还检测了 GqDNVs 在小鼠体内的分布情况，发现 GqDNVs 注射到小鼠股四头肌后，能够被肌肉吸收。 

• GqDNVs 能减轻 Dexamethasone 引起的小鼠骨骼肌萎-缩,改善小鼠骨骼肌功能。在肌萎-缩模型小鼠中,肌肉注射 GqDNVs 可增加股四头肌的横截面积、握力及 AMPK/SIRT1/PGC1α 通路的表达。

• 此外，股四头肌能量靶向代谢组分析表明，GqDNVs 上调氨基糖和核苷酸糖的代谢、自噬和氧化磷酸化过程，从而激活肌肉再生。

03
小结

在这项研究中，客户使用 PKH 26 (MedChemExpress) 成功追踪了 C2C12 细胞中 GqDNVs 的细胞摄取，展示了染料能够清晰地可视化细胞过程，证实了GqDNVs 可被 C2C12 细胞吸收。 不知如何下手的小伙伴们可以学起来啦~

参考文献：

[1] Zhou X, et al. Gouqi-derived nanovesicles (GqDNVs) inhibited dexamethasone-induced muscle atrophy associating with AMPK/SIRT1/PGC1α signaling pathway. J Nanobiotechnology. 2024 May 22;22(1):276.