在生物技术和制药领域，细胞和生物制品的支原体污染是一个需要高度关注的问题。支原体是一类微小的原核生物，其污染可能导致产品质量下降，甚至引发严重的安全问题。因此，欧洲药典（EP）和日本药典（JP）都对细胞和生物制品的支原体检测做出了详细的规定，并强调了方法学验证的重要性。
支原体检测的描述
欧洲药典和日本药典均指出，无论是生物源性原材料、采用细胞培养技术制备的疫苗、抗体，还是细胞或基因治疗产品，在其生产过程的各个阶段都必须进行支原体污染的检测。支原体检测的方法主要是基于核酸扩增技术（NAT），如PCR（聚合酶链反应）和qPCR（荧光定量PCR）等。这些技术通过检测支原体的特异核酸序列，以确定细胞上清或生物制品中是否存在支原体污染。
方法学验证的规定
1. 灵敏度（检测限）验证
欧洲药典和日本药典都要求NAT法的灵敏度必须达到一定的标准。具体而言，如果NAT法用于替代传统的培养法，其检测限需达到10CFU/ml（菌落形成单位/毫升）。这意味着，NAT法能够检测到每毫升样品中至少10个支原体菌落。如果NAT法用于替代DNA染色法，其检测限则需达到更高的100CFU/ml。
为了确保NAT法的灵敏度达到这一标准，需要使用支原体灵敏度标准品进行验证。这些标准品通常是冻干粉型的灭活支原体，涵盖了药典规定的所有支原体物种。通过将这些标准品与待测样品一起进行检测，可以验证NAT法的检测限。
2. 特异性验证
特异性是指NAT法能够准确识别并检测的支原体物种，而不与其他细菌或哺乳动物DNA发生交叉反应。欧洲药典和日本药典都规定了NAT法应能检测的常见支原体物种，如莱氏无胆甾原体、发酵支原体、猪鼻支原体等。同时，药典还要求NAT法应检查与细菌、哺乳动物DNA是否有交叉反应。
为了验证NAT法的特异性，可以使用支原体基因组DNA标准品进行试验。这些标准品包含了特定支原体物种的基因组DNA，通过PCR或qPCR检测可以验证NAT法对这些支原体物种的识别能力。
3. 耐用性验证
耐用性是指NAT法在检测过程中不受方法参数的小的偏差的影响，如浓度的变化（MgCl2、引物、dNTP）、提取步骤的细微差别等。这要求NAT法的检测结果具有稳定性和可靠性，不受人为操作误差的影响。
耐用性验证通常通过多轮不同时间段内的检测来实现，每轮进行多次重复检测，最后观察结果的变化。这样可以确保NAT法在不同的实验条件下都能得到稳定可靠的结果。
欧洲药典和日本药典对细胞和生物制品的支原体检测做出了详细的规定，并强调了方法学验证的重要性。通过灵敏度、特异性和耐用性三个方面的验证，可以确保NAT法在支原体检测中的准确性和可靠性。这对于保障生物制品的质量和安全性具有重要意义。
在实际操作中，生物制品和细胞治疗产品的生产企业需要按照药典的要求选择合适的支原体检测方法和试剂盒，并进行方法学验证。同时，他们还需要注意样本的采集、处理和储存等环节，以确保检测结果的准确性和可靠性。只有这样，才能为消费者提供安全、有效的生物制品和细胞治疗产品。
