蛋白磷酸化/去磷酸化是一种非常重要且广泛的细胞调节机制，许多酶、受体蛋白都是通过激酶/磷酸酶的磷酸化/去磷酸化来调节其功能的激活或抑制。特别是蛋白激酶负责大量细胞转导信号，并与肿瘤、自身免疫病、炎症性疾病、退行性神经疾病等有着密切关联。因此蛋白激酶和蛋白磷酸酶也是非常重要的热门药物靶点，且对应的新型药物形式也不断被开发。
蛋白激酶是将ATP末端的磷酸基团(PO4)转移到含有羟基的底物蛋白氨基酸残基上，从而实现磷酸化过程。蛋白磷酸化是最常见且最重要的翻译后修饰（PTMs）之一，在真核生物中，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸是主要的磷酸化位点，特别是丝苏氨酸的占比非常大，酪氨酸磷酸化相对较少。通常依据激酶对于底物氨基酸的选择性，可将蛋白激酶分为丝/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶。
而磷酸酶与蛋白激酶功能相反，它是通过将磷酸单酯水解成一个磷酸基团和一个带有游离羟基的分子来去除磷酸化的蛋白质上的磷酸基团。去磷酸化作用同样主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上。
至今，全球已获批的蛋白激酶抑制剂药物靶点约占已知人类激酶组类型的20%，因此新型激酶药物的开发仍有巨大空间。
基于生化水平的激酶抑制剂高通量筛选
使用HTRF/LANCE（均相时间分辨荧光）技术可实现激酶抑制剂的高通量筛选。（图2所示），该方法将铕标记于识别底物磷酸化的抗体上，作为 “供体” 荧光分子。而在多肽底物上标记 “受体” 荧光分子，当多肽底物被磷酸化时，就能够被抗体识别，从而产生FRET信号。
如下（图3）中MELK激酶活性的检测实验，在优化好反应条件之后，即可利用该检测方法筛选激酶抑制剂，测出星形孢菌素对MELK的IC50为9.8nM左右。
基于细胞水平的激酶抑制剂高通量筛选
细胞激酶信号转导通路参与调控许多重要的细胞过程，如细胞存活、分化和凋亡。激酶信号网络的典型特征是多个激酶排列在级联中。HTRF/ALPHA技术已经开发用于研究激酶信号通路，以及筛选化合物文库以寻找修饰受体或激酶活性。如（图4）所示，使用ALPHA技术在A375细胞上测试两款激酶抑制剂 (MEK抑制剂：U0126和PD 98059) ，检测其对pERK和pAKT的产生的抑制能力，分别测得U0126 的IC50为28.7 nM，PD 98058的IC50为0.66 μM。
LANCE技术可以检测丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸磷酸酶的活性。使用ULight标记的磷酸化肽作为酶底物，通过检测肽的去磷酸化的信号来表征磷酸酶反应活性，磷酸酶抑制剂会部分或全部恢复原来的TR-FRET信号。（图5）使用磷酸化的ULight标记肽4E-BP1 (pThr46) 对PP1A和PP2A磷酸酶进行检测。结果表明信号减少的模式与使用32P放射性标记肽一致，并且LANCE用到的酶量更少，LANCE技术非常适合于开发稳健和敏感的信号减少磷酸酶测定，并用于表征抑制剂的效果。
HTRF激酶活性检测试剂盒
胞内蛋白检测试剂盒
参考文献
[1] Ardito F, Giuliani M, Perrone D, Troiano G and Lo Muzio L: The crucial role of protein phosphorylation in cell signaling and its use as targeted therapy (Review). Int J Mol Med 40: 271-280, 2017
