利用步琦SFC系统纯化
阿司匹林、苯佐卡因和普鲁卡因
SFC应用
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简介
化学合成常伴有杂质，因产率很少达 100%，杂质会严重影响药物疗效、安全和质量，所以纯化药物保障其纯度和完整性至关重要，在现代药物研发的过程中往往通过色谱法等多种方法纯化。
在上一篇应用文章《利用步琦 SFC 系统纯化利多卡因与乙酰氨基酚》中，我们使用超临界流体色谱（SFC）高效纯化了利多卡因和乙酰氨基酚的合成产物。在此过程中，我们先使用步琦 Sepmatix 8x SFC 平行色谱系统快速筛选了色谱柱，之后将其放大到 BUCHI Sepiatec SFC-50 超临界制备色谱系统上。本次应用中，我们依旧会使用同样的工作流程去纯化阿司匹林、苯佐卡因和普鲁卡因的合成产物。
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实验设备
BUCHI Sepmatix 8x SFC 8通道平行色谱系统
BUCHI Sepiatec SFC-50 超临界制备色谱系统
BUCHI PrepPure 硅胶，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure 二醇基，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure 氨基，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure 2-EP，5um,250×4.6mm
HILIC柱，5um,250×4.6mm (Dr. Maisch GmbH)
BUCHI PrepPure PEI，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure PEI，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure CBD，5um,250×4.6mm
氰基柱，5um,250×10mm ，(Dr. Maisch GmbH)
BUCHI PrepPure 2-EP，5um,250×10mm
BUCHI PrepPure 二醇基，5um,250×10mm
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化学品与样品
化学品：
二氧化碳 (99.9%)
甲醇 (≥99%)
甲醇溶液中 2M 的氨溶液
甲酸（99%）
去离子水
为了安全处理，请注意所有相应的MSDS！
样品：
普鲁卡因合成产物
阿司匹林合成产物
苯佐卡因合成产物
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程序设定
BUCHI Sepmatix 8x SFC 平行色谱柱系统
流动相：A= 二氧化碳；B= 甲醇
柱尺寸：250×4.6mm
流速：3mL/min（每根色谱柱）
检测：DAD 紫外扫描 200 nm - 600 nm
流动相条件：
0 – 0.5 min | 5 % B | |
0.5 – 8.0 min | 5 – 50 % B | |
8.0 – 9.4 min | 50 % B | |
9.4 – 9.5 min | 50 – 5 % B | |
9.5 – 10 min | 5 % B | |
筛选运行全自动运行，流速设置为 3mL/min 每通道，使用流控单元，平衡每一根色谱柱。样品自动注入（V=5μL），并开始平行筛选（运行时间=10min）。背压调节器设置为 150 bar，柱子加热至 32℃，可按需往改性剂中加入添加剂改善峰型。
BUCHI Sepiatec SFC-50 超临界制备色谱系统
流动相：A= 二氧化碳；B= 甲醇
柱尺寸：250×10mm
流动相条件：等度运行条件
检测：紫外
所有 10mm ID 色谱柱都在预设流速下平衡 3 分钟，使用自动进样器上样，并开始运行。背压调节器设置为 150 bar，柱子加热至 40℃，可按需往改性剂中加入添加剂改善峰型。
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结果
5.1 阿司匹林
阿司匹林，化学名为乙酰水杨酸（下称 ASA），是一种镇痛和抗炎药物。它属于非甾体抗炎药（NSAIDs）这一类。可以通过将水杨酸（下称 SA）与乙酸酐发生酯化反应而化学合成（见图5） [1] 。为了确定乙酰水杨酸的理想分离选择性，首先进行了色谱柱柱筛选（见图1）。
▲ 图 1：顶部：阿司匹林合成的反应方程式，底部：Sepmatix 8x SFC 仪器色谱柱筛选结果；从左到右：硅胶，氨基，二醇基，氰基，2-EP，HILIC，PEI和CBD；运行时间 = 10分钟。
由于 SA 在固定相中的保留性较高，为了强制洗脱 SA，在梯度中增加了一个等度步骤，即在 50% 改性剂浓度下进行 5 分钟的等度洗脱。在 HILIC 相中，ASA 和 SA 只有噪音而无洗脱。在 PEI 相中，在实验条件下只有 ASA 被洗脱。除氰基相外，其余各相均显示出 ASA 和 SA 的分离。结合分离时长和分辨率而言，2-EP 相的结果最好（见表 1）
▲ 表1：样品在不同固定相色谱柱条件下的分辨率值和洗脱顺序
选择 2-EP 相作为固定相，放大至制备规模。在色谱柱筛选的过程中，ASA 和 SA 在 2-EP上被洗脱的甲醇比例为 26 - 40%。图 2（上）显示了在甲醇比例为 40% 的10x250mm 2-EP 色谱柱上纯化 ASA 和 SA 的情况。改性剂中添加了甲酸（0.5%），以改善 SA 的峰形。在不添加甲酸的情况下，SA 的拖尾非常严重。在相同条件下，可采用叠加进样法自动纯化 ASA（见图2下），并进行馏分收集。
▲ 图 2：ASA 纯化的单次进样（上图）和叠加进样（下图）；运行条件：流速 = 30 mL/min，改性剂 = 甲醇 + 0.5 % 甲酸，改性剂 % = 40 %，温度 = 40 °C，压力 BPR = 150 bar，进样量 = 200 μL，紫外波长 = 254 nm；叠加进样条件：进样次数 = 10，叠加时间 = 2.0 min，馏分 = 1（基于时间）。
5.2 苯佐卡因
苯佐卡因（下称 BC），化学名为对氨基苯甲酸乙酯，属于局部麻醉剂类。它可以从对氨基苯甲酸（下称 PABA）通过酸催化羧基与乙醇的酯化反应化学合成，用硫酸作为催化剂 [2]。首先进行色谱柱筛选，以确定苯佐卡因合成产物理想的分离选择性（见 图3）。
▲ 图3：顶部：苯佐卡因合成反应方程式，底部：Sepmatix 8x SFC仪器色谱柱筛选结果；从左到右：硅胶，氨基，二醇基，氰基，2-EP，HILIC，PEI和CBD；运行时间 = 15分钟。
由于 PABA 在固定相中的保留性较强，因此在梯度中增加了一个等度步骤，在 50% 甲醇的条件下运行 5 分钟，硫酸通过洗涤步骤去除避免过高的酸性。各固定相的色谱图显示，每种固定相都能分离苯佐卡因，但是洗脱速度和分辨率存在很大差异（见表2）。HILIC 和氨基相的分辨率最高，但 PABA 的保留时间过长，即使用50%的甲醇洗脱，依旧需要很长时间。
▲ 表2：样品在不同固定相色谱柱条件下的分辨率值和洗脱顺序。
结合柱筛选结果，最终选择二醇基相作为制备色谱柱。HILIC 和氨基相需要较高比例的甲醇和较长的运行时间。二醇基相不仅可以非常快速地洗脱样品，并具有足够高的分辨率。二醇基柱的筛选结果表明，BC 和 PABA 在甲醇比例为 30 - 40% 时即可洗脱。
图 4（上图）显示了 10 x 250mm 的二醇基色谱柱在甲醇比例为 28% 时对苯佐卡因的纯化情况。在相同条件下，可采用叠加进样法自动纯化 BC（见图4下），并进行馏分收集。
▲ 图 4：苯佐卡因的单次注射（顶部）和堆叠注射（底部）纯化；运行条件：流速 = 20 mL/min， 改性剂 = 甲醇，改性剂 % = 28%，温度 = 40 °C，压力 BPR = 150 bar，注射量 = 90 μL，UV 波长 =276nm；堆叠注射条件：注射次数 =12，堆叠时间 =0.66min，馏分 =1（基于时间的）。
5.3 普鲁卡因
普鲁卡因（下称 PC），化学名为 4-氨基苯甲酸 2-(N, N-二乙基氨基)乙酯，是一种药物，具有局部麻醉作用。它阻断电压依赖性钠离子通道，从而导致例如疼痛敏感性的降低。普鲁卡因可以通过化学方法在碱性条件下从 4-氨基苯甲酸乙酯（下称ABE）合成。这涉及到使用 2-二乙基氨基乙醇进行酯交换[3]。碱是乙醇钠醇，它可以通过钠与乙醇的反应产生。为确定普鲁卡因合成产物纯化的理想选择性，进行了色谱柱筛选（见图 5）。
▲ 图5：顶部：普鲁卡因合成的反应方程式，底部：Sepmatix 8x SFC 仪器色谱柱筛选结果；从左到右：硅胶，氨基，二醇基，氰基，2-EP，HILIC，PEI 和 CBD；运行时间 = 15分钟。
由于普鲁卡因在固定相中的保留性较高，因此在梯度中增加了一个等度步骤，即在 50% 甲醇浓度下进行 5 分钟的梯度。结果显示，每种固定相对普鲁卡因的纯化都有合适的选择性（见表3）。普鲁卡因在硅胶、PEI 和氰基固定相中的保留性较高。
由于普鲁卡因的基本特性，在部分色谱柱上的峰形非常不对称。二醇基相下的峰前沿非常明显，不对称度系数为 0.58，而硅胶相下的拖尾非常明显，不对称度系数为 2.73。
▲ 表3：样品在不同固定相色谱柱条件下的分辨率值和洗脱顺序。
结合柱筛选结果，选择 2-EP 相放大为制备纯化的方法。硅胶相需要高含量的甲醇才能洗脱出 PC，导致运行时间长，峰形不佳。而 2-EP 相既可以快速洗脱样品，又具有足够高的分辨率。为了改善峰型，在甲醇改性剂中加入 5 % 的去离子水和 20 mM 的氨水作为添加剂。
筛选结果表明，PC 和 ABE 在改性剂含量约为 24 - 32% 时可以从色谱柱内洗脱下来。图6（上图）显示了10 x 250mm 的 2-EP 色谱柱在改性剂含量为 25% 时纯化 PC 的情况。在相同条件下，可采用叠加进样法自动纯化 PC（见图6，下图）并收集馏分，添加添加剂可显著改善 PC 的峰形。
▲ 图 6：普鲁卡因纯化的单次进样（上图）和叠加进样（下图）；运行条件：流速 = 20 mL/min，改性剂 = 甲醇/水（95/5 %）加 20 mM 氨水，改性剂 % = 25 %，温度 = 40 °C，压力 BPR = 150 bar，进样量 = 100 μL，紫外波长 = 220 nm；叠加进样条件：进样次数 = 10，叠加时间 = 1.1min，馏分 = 2（基于时间）。
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结论
超临界制备色谱纯化合成产物高效快速，但需筛选合适的色谱填料。BUCHI Sepmatix 8x SFC 平行色谱系统可快速筛选填料并放大至制备规格，既能提高样品分离度，又能充分利用色谱柱上样量，为 BUCHI Sepiatec SFC-50 制备系统的叠加进样奠定良好基础，二者结合可达到降本增效的目的。
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参考文献
Th. Eicher und H. J. Roth; Synthese, Gewinnung und Charakterisierung von Arzneistoffen, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1986).
Winterfeld, K. – Praktikum der organisch-präparativen Pharmazeutischen Chemie, 6. Auflage, Steinkopff Verl., Darmstadt (1965).
Axel Kleemann, Jürgen Engel, Bernd Kutscher und Dietmar Reichert: Pharmaceutical Substances, 4. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (2000).
