一文带你了解qPCR原理与流程，建议收藏再看！

qPCR实验流程包括RNA提取、逆转录和qPCR。

qPCR探针法是一种使用荧光探针来测量PCR产物的技术。在PCR反应中，荧光探针会与PCR产物的特定序列结合，并发生荧光变化。随着PCR反应的进行，PCR产物的数量增加，荧光探针与PCR产物结合的数量也会随之增加。通过测量荧光信号的强度，可以确定PCR产物的数量。

qPCR染料法是一种使用DNA结合染料来测量PCR产物的技术。在PCR反应中，DNA结合染料会与PCR产物的双链DNA结合，从而发生荧光变化。随着PCR反应的进行，PCR产物的数量增加，DNA结合染料的荧光信号也会随之增加。通过测量荧光信号的强度，可以确定PCR产物的数量。

样本采集与保存

RNA提取的第一步是样本采集和保存。对于细胞和组织样本，需要在采集后尽快进行RNA提取，以避免RNA的降解。对于血液样本，需要使用RNA稳定剂或直接进行RNA提取。另外，样本的保存温度和时间也需要根据不同的实验目的进行选择。

样本处理

样本裂解

样本裂解是将细胞膜破坏，使RNA释放到溶液中的过程。常见的样本裂解方法包括机械裂解、化学裂解和热裂解等。

提取纯化

RNA提取后，需要进行纯化并去除DNA、蛋白质和其他杂质。RNA纯化试剂盒、硅胶柱和磁珠等方法都可以用于RNA提取后的纯化。需要注意使用RNase-free试剂和器具，并在纯化过程中避免RNA的降解。

质量检测

逆转录反应

逆转录反应是将RNA转录成cDNA的过程。将提取的RNA与逆转录酶、引物（如oligo(dT)或随机引物）和dNTPs混合，在适宜的温度下进行反转录反应，合成cDNA。

逆转录反应温度和时间需要根据逆转录酶的不同而进行选择。

cDNA纯化

逆转录反应后，需要将cDNA纯化并去除RNA、逆转录酶等杂质。可以使用cDNA纯化试剂盒或磁珠等方法进行纯化。

引物设计

qPCR染料法的引物设计原则与其他PCR反应的引物设计原则基本相同，主要考虑以下因素：

(1)引物长度：通常为18-24个碱基对；

(2)引物Tm值：应当在55-65℃之间；

(3)引物特异性：应当避免与非目标序列的互补；

(4)引物末端修饰：可以增强引物的特异性和稳定性。

内参选择

内参是用于校正样品间差异的参照基因。内参应当具有以下特点：

(1)在不同样品中表达稳定；

(2)与目标基因同等易检测；

(3)不会受到实验条件的影响。

常见的内参包括GAPDH、Actin、Tublin等。

模板用量

确定qPCR实验中cDNA模板的稀释度数需要进行预实验来确定最佳的稀释倍数。以下是一些步骤：

(1)准备一系列不同浓度的cDNA稀释液，例如原液、1:10、1:100等；

(2)进行qPCR反应，并记录Ct值；

(3)选择Ct值在18-28范围内的稀释倍数。

程序设置

在qPCR实验中，程序设置通常包括以下步骤（具体参照说明书进行）：

(1)预变性：95℃，5min；

(2)循环反应：95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；40个循环。

注：循环反应可分为两步法和三步法。两步法将常规PCR反应中的退火、延伸步骤进行合并，因此减少了反应步骤、缩短了反应时间。一般情况下，使用两步法程序进行扩增即可满足实验需求。如果模板浓度低或qPCR扩增效率低时，可尝试三步法反应程序。

在分子生物学研究和临床诊断领域，实时荧光定量PCR（qPCR）技术以其高灵敏度、高特异性和准确性而成为不·可·或·缺的工具。

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高灵敏度和宽线性范围

手动纯化下的检测限（LoD）为6 IU/ml，线性范围从5至1x10^8 IU/ml，这表明试剂盒具有出色的灵敏度和宽泛的定量范围。

广泛的基因型覆盖

能够检测1至8型HDV RNA，适用于全球不同地区流行的HDV基因型。