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2024/11/12 18:02:21PCR程序设置和什么有关?影响大么?
一旦确定了合适的DNA起始量和PCR组分,就必须设定PCR循环和运行参数,从而确保高效扩增。
DNA聚合酶的特点、PCR缓冲液的类型、模板DNA的复杂程度都会影响反应条件的设置。
1、起始高温变性步骤
在PCR起始阶段,通常是在94–98℃下孵育1-3min将双链DNA模板解离成单链,从而使引物可与目标区域结合并开始延伸。
此步的高温条件使起始DNA变性,确保在第一个扩增循环期间实现有效的目标序列扩增,此外也有助于使样品中可能存在的热不稳定性蛋白酶或核酸酶失活,从而保证它们极小影响热稳定性DNA聚合酶。
同时,当使用热启动DNA聚合酶时,此步同时可以激活该聚合酶。
起始变性步骤,该步骤的时间和温度取决于模板DNA的性质和缓冲液的盐浓度。
例如,哺乳动物基因组DNA可能比质粒和PCR产物需要更长的孵育时间(具体取决于DNA的复杂程度和大小)。
同样,高GC含量(如, >65%)的DNA通常需要更长的孵育时间或更高的温度。高盐浓度的缓冲液(满足某些DNA聚合酶的需要)同样需要更高的变性温度(如,98℃),以使双链DNA解离。
在95℃以上长时间孵育,很容易使Taq DNA聚合酶等DNA聚合酶变性。为弥补在该步骤中酶损失的活性,可能需要在起始变性步骤后添加更多的酶,或在一开始加入多于建议用量的DNA聚合酶。高度热稳定的酶(如来自Archaea的酶)能够耐受长时间高温孵育,在整个PCR过程中保持活性。
2、循环变性步骤
起始变性步骤后,后续PCR循环以一个独立的变性步骤开始,并在94–98℃条件下持续0.5-2min。
与起始模板DNA变性步骤一样,该步骤的时间和温度也可根据模板DNA、DNA聚合酶和缓冲液成分的性质进行优化。
例如,更长时间和/或高温条件对长片段和/或富含GC的目的片段可能是有利的。
甘油、DMSO、甲酰胺和甜菜碱等添加剂的存在,可促进变性步骤期间双链DNA的解离并提高特异性,从而无需长时间或高温条件。
3、引物退火步骤
在该步骤中,目的是降低反应温度,使引物与目标DNA结合。
通常,0.5-2min的孵育时间足以供引物完成退火。通过计算PCR扩增引物的熔解温度(Tm),可确定退火温度。根据一般经验法则,起始退火温度比引物低至Tm低3–5℃。
Tm指50%的引物与其互补序列形成双链时的温度,可通过多种方法进行计算。引物Tm估算简单的方法是利用DNA寡核苷酸中的核苷酸数量进行计算,公式如下:Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T)。
由于反应的盐浓度 (Na⁺) 会影响引物退火,因此,使用以下公式能够更加准确地计算Tm:Tm=81.5+16.6(log[Na⁺]) + 0.41(%GC)–675/引物长度。
Tm计算需考虑的一个重要因素是PCR添加剂、辅助溶剂和修饰核苷酸的使用。这些试剂的存在会降低引物-模板复合物的Tm。
例如,10%DMSO会使退火温度降低5.5–6.0℃。同样,在PCR中使用7-deaza-dGTP取代dGTP也会降低Tm。此时,应相应调整退火温度。
7-Deaza-dGTP是一种人工合成的dGTP类似物,可作为大多数DNA聚合酶(包括Taq DNA Polymerase)的底物。
与dGTP相比,7-Deaza-dGTP具有更高的电子亲和力化学稳定性,这使得它在DNA合成反应中更容易被酶识别和嵌入,从而提高了DNA合成的效率和准确性。7-Deaza-dGTP掺入DNA后可影响DNA的荧光染色和电泳迁移率;与dITP相比,7-Deaza-dGTP提升了长序列区域的易读性。
7-Deaza-dGTP替代或部分替代dGTP扩增富含GC的DNA序列,可提升有效降低PCR反应错误率,提高PCR产物产量,使DNA测序更加简单高效,广泛应用于富含GC的DNA序列的PCR扩增、测序和基因克隆等生物实验,在疾病诊断中发挥重要作用。
应注意,计算所得 Tm 值就是引物退火的起始参考温度。退火温度可能需要根据扩增结果进行进一步优化。
例如,如果结果为无扩增条带或扩增水平很低,则优化时应以2–3℃增量逐渐降低退火温度。但是,如果出现非特异性PCR产物,则以2–3℃增量逐渐提高温度(最高至延伸温度),提高特异性。
4、引物延伸步骤
引物退火后,便是延伸引物的3'末端,产生模板的互补链。该步中,DNA聚合酶的5'→ 3'聚合酶活性引入dNTP并合成子链。
反应温度升高至酶的最佳温度(热稳定DNA聚合酶的最佳温度通常为70–75℃),使其达到最高活性。
如果引物退火温度与延伸温度相差不超过3℃,则退火和延伸温度可合并为一步,称为两步PCR法。两步PCR法无需在退火和延伸之间转换和稳定温度,从而缩短了PCR所需的时间。
PCR的延伸时间取决于DNA聚合酶的合成速度以及目标DNA的长度。
Taq DNA聚合酶的一般延伸时间是1min/kb,而 Pfu DNA聚合酶为2min/kb。因此,“缓慢型”聚合酶比“快速型”聚合酶需要更多的扩增时间,才能获得相等的得率。
同样,长DNA扩增子比短DNA需要更长的延伸时间,才能实现全长复制。当扩增长目的片段(如, >10 kb)时,除了需要增加延伸时间,还需要降低PCR温度,以确保引物结合并在长时间循环中维持酶活性。
5、PCR循环数设置
为扩增目标DNA,需重复PCR的变性、退火和延伸步骤多次。循环数通常为25-35次,具体取决于DNA起始量和所需的目标PCR产物得率。
如果DNA起始量少于10拷贝数,则可能需要多达40个循环,才可获得足够的得率。不建议使用超过45个循环,因为过多的循环数会产生非特异性条带。而且,副产物的累积和反应组分的消耗会大大降低PCR效率,使PCR扩增曲线出现平台期。
相反,较少的循环数更适合于无偏倚扩增(如下一代测序)以及目标DNA的准确复制(如克隆)。
6、最终延伸步骤
最后一个PCR循环完成后,即为最终延伸步骤。该步中,将PCR混合物在延伸温度(通常为72℃)下最后孵育5-15min。其持续时间取决于扩增子长度和组成,以确保全长复制以及高目标DNA片段得率。
在该步骤中,除了填补不完整末端外,Taq DNA 聚合酶等具有末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性的DNA聚合酶还会在PCR引物的3'末端添加额外的核苷酸。
因此,如果PCR扩增子被克隆到TA载体中,建议最终的延伸步骤持续30min,以确保生成合适的3'-dA尾部结构以实现有效的PCR克隆。
参考文献:
[1]PCR循环参数—成功的六大关键因素-赛默飞
[2]7-Deaza-dGTP (10mM, for GC-Rich PCR/Sequencing)-碧云天
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