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2024/11/14 17:50:14一、引物探针的使用步骤
引物探针使用步骤一:
设计引物和探针:首先需要根据目标DNA序列设计特异性引物和探针。引物的长度一般为20-25个核苷酸,探针的长度一般为15-25个核苷酸。设计时要注意避免非特异性扩增,确保引物的特异性和探针的Tm值比引物Tm值高8-10°C。
引物探针使用步骤二:
提取模板DNA:从待测样本中提取DNA,作为PCR反应的模板。确保模板DNA的质量和浓度,以获得可靠的实验结果。
引物探针使用步骤三:
配制PCR反应体系:根据实验需求,配制含有引物、探针、dNTPs、DNA聚合酶等试剂的PCR反应体系。调整各试剂的浓度和比例,确保反应体系的准确性。
引物探针使用步骤四:
PCR扩增:将PCR反应体系放入PCR仪中,进行扩增。一般包括以下步骤:94℃预变性5分钟;94℃变性30秒,退火温度(一般为55℃)退火30秒,72℃延伸30秒,进行30-40个循环;最后72℃延伸5分钟。
引物探针使用步骤五:
分析PCR产物:将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,观察扩增条带的大小和亮度,初步判断实验结果。然后通过荧光检测仪分析荧光信号,实现对目标序列的定量分析。
二、引物探针的设计原则和注意事项:
1. 引物长度:一般为18-24 bp,过长或过短都会影响扩增效率。
2. Tm值:荧光定量PCR引物的Tm一般介于59~68°C之间,上下游引物的Tm值相差最好不超过2°C。
3. GC含量:引物的GC含量应在40%~60%之间,上下游引物的GC含量不能相差太大。
4. 避免二级结构:扩增产物不能形成二级结构,选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。
5. 引物自身及引物之间不应存在互补序列:引物自身及引物之间不应存在超过4个连续互补的碱基,以防止引物二聚体的形成。
通过掌握这些基本步骤和设计原则,可以确保引物探针验证实验的准确性和高效性。如需购买探针请联系——天津益元利康生物科技有限公司!