各位读者好，今天为大家解读的文献是由浙江大学邵逸夫医院团队、安徽医科大学第一附属医院团队、南京鼓楼医院团队联合北京中日友好医院团队在Nature Communications发表的，题为“Unraveling the spatial organization and development of human thymocytes through integration of spatial transcriptomics and single-cell multi-omics profiling”。
人类胸腺细胞（thymocytes）的发育和空间组织是免疫学研究的重要领域，对于理解T细胞成熟和免疫功能至关重要。当前，研究者们主要通过流式细胞术和单细胞转录组分析来研究胸腺细胞的发育，但这些方法无法提供细胞的空间信息，限制了对胸腺微环境和细胞间相互作用的深入理解。
尽管单细胞多组学技术的发展为胸腺细胞的研究提供了新的视角，但如何将这些高维数据与细胞的空间位置信息相结合，仍是一个技术挑战。此外，胸腺细胞发育过程中的细胞间通讯和微环境影响因素的识别也是研究中的难点，需要更精细的空间分辨率和多维度数据整合方法来克服。
本研究通过整合空间转录组学和单细胞多组学分析，深入探究了人胸腺细胞的空间组织和发育过程。研究揭示了T细胞发育、空间组织在单细胞分辨率下的动态变化，以及与T细胞成熟相关的TCR信号传导变化，为理解基础免疫机制和潜在的临床应用提供了宝贵的见解和数据资源。
空间转录组学和单细胞多组学结合应用已在众多研究领域展现出巨大潜力。上海达为科可开展空间转录组和单细胞多组学结果分析与解读，进行相关分子对接、蛋白互作靶点预测，继而开展后续相关研究。
Fig.1a研究设计示意图
研究框架：
1.研究问题：
文章旨在探索人类胸腺细胞的空间分布和发育轨迹，以及不同胸腺细胞亚群之间的相互作用。
2.研究方法：
利用空间转录组技术（ST）和单细胞测序技术对胸腺组织进行分析。
采用CellChat工具评估胸腺细胞亚群间的相互作用。
利用Seurat的AddModuleScore函数和Monocle2进行细胞亚群的相对距离评估和轨迹分析。
应用GO富集分析和扩散图谱分析来探究T细胞亚群的功能和发育轨迹。
3.数据分析：
对胸腺细胞的空间分布进行聚类和区域划分，确定髓质和皮质区域。
通过广义线性高斯模型分析细胞类型随空间距离的变化。
识别与空间距离显著相关的基因（DVGs）。
4.结论：
揭示了胸腺T细胞发育的基本结构单元——胸腺小叶的精确分割。
描述了不同T细胞亚群相对于髓质中心的空间分布。
通过GO分析和轨迹分析，深入理解了T细胞亚群的功能特性和发育路径。
文章通过综合分析，为理解人类胸腺细胞的发育和功能提供了新的视角，并为胸腺相关疾病的研究提供了潜在的生物标志物。
结果解析：
研究者通过对16个不同发育阶段的胸腺样本包括产前（4个样本）、儿童（8个样本）、成人（2个样本）和老年（2个样本）阶段进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，揭示了不同细胞亚群在胸腺中的发育轨迹。总结样本信息后经过质量控制、整合、主成分分析（PCA）和无监督聚类，利用典型标记，将聚集的细胞预先注释为六大谱系，并对B细胞、髓系细胞、基质细胞和T细胞进行第二轮聚类，共划分为34种不同的细胞亚型。后续发现，未成熟的T细胞亚群，如双阴性细胞（DN_early, DN_blast）与年龄呈拮抗关系，在产前阶段最为丰富，而部分成熟的T细胞（如CD4+ T记忆细胞和调节性T细胞）在成人和老年群体中更为丰富。这些结果表明，胸腺的纤维化和老化影响了T细胞的发育，并与胸腺内细胞类型的空间分布变化有关。
通常，T 细胞发育和成熟沿着胸腺小叶内的 C-MC-M 轴发生（C：皮质区域；M：髓质区域；MC：髓质-皮质边界）。为了准确识别这些区域进而深入了解不同细胞类型在 T 细胞发育过程中可能发挥的作用。研究者开发了 TSO-his算法对胸腺切片进行空间分区的结果，揭示了不同细胞类型在皮质-髓质（C-MC-M）轴上的空间分布。结果显示，未成熟的T细胞（如DN_early和DP_blast）主要集中在皮质区，而成熟的T细胞（如CD4+ T和CD8+ T细胞）则集中在髓质区。此外，基质细胞如成纤维细胞（Fb）和内皮细胞（Endo）在髓质区富集，表明这些细胞类型在调控T细胞发育中的重要作用。
通过分析八例胸腺样本，研究者共识别出1885个显著差异表达基因，这些基因在皮质和髓质区域表现出不同的空间分布特征。通过对胸腺不同解剖区域中显著差异表达的基因（DVGs）的空间分布及其功能富集分析，进一步揭示了其在T细胞选择和发育中的功能。后续研究者使用TSO-his确定了前五个在皮质和髓质区域显著上调的基因，如CCL19和CCR7。CCL19是髓质中zui显著上调的基因，并在mTECs中特异性表达，而其配体CCR7在成熟T细胞中高水平表达，这些基因协同作用促进了成熟T细胞从胸腺迁移至外周。此外，ELOVL4和CD99的表达在皮质区显著升高，特别是在DP阶段，表明其在双阳性T细胞的TCRα链重排和阳性选择过程中具有关键作用。
紧接着研究者分析揭示了在双阳性重排（DP_re）阶段，ELOVL4和CD99基因表达的富集，并且这与它们相应的RNA表达谱结果一致。通过小鼠的基因敲除实验，研究者发现与对照组相比，ELOVL4缺失导致CD4+ T细胞数量显著减少，并且有趣的是，ELOVL4的缺乏导致细胞因子(包括白细胞介素2 (IL-2)和干扰素-γ (IFN-γ))的产生减少，同时在受TCR + CD28刺激的这些T细胞的增殖能力受到抑制。相比之下，这一现象在CD99-KO骨髓中未观察到，表明ELOVL4在CD4+ T细胞发育中的关键调节作用。
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接下来研究者通过TSO-hismap工具，将scRNA-seq数据精确映射到空间转录组学坐标，生成胸腺的单细胞分辨率空间图谱。并且与其他工具（如Seurat坐标转换(SrtCT)、CellTrek和CARD）相比，发现TSO-hismap在区分皮质和髓质细胞类型方面表现出更高的精确性。同时进一步测量了不同细胞类型与髓质中心的相对距离，揭示了未成熟T细胞（如DP_blast）主要集中在皮质区，而成熟T细胞和mTEC则在髓质区富集。这些结果表明，TSO-hismap工具能够准确捕捉胸腺中不同细胞类型的空间分布，并揭示其在T细胞发育过程中的关键作用。
后续研究者通过使用TSO-hismap以单细胞分辨率分割斑点来评估不同细胞类型的共定位程度。首先展示了 cTECs高度集中在近端皮质-髓质交界处和血管周围，并与某些DP_re细胞强烈共定位。还观察到Fb细胞富集在血管周围的皮质区域，并与cTEC共定位。这一发现提供了它们参与T细胞分化的潜在证据。同时，在髓区观察到mTEC与CD 4 + T和CD 8 + T细胞的强共定位。另外，CD 8aa细胞在髓质-皮质边界附近富集，还显示出与记忆细胞以及Mono细胞的显著共定位。同时免疫荧光染色进一步证实了这些细胞的共存，然而，这些细胞与CD8aa细胞之间相互作用的性质仍不清楚，需要进一步探索。此外研究者还展示了从远端皮质到内部髓质，人类T细胞发育不同阶段的胸腺细胞类型的空间共定位示意图。
接下来研究者使用了常规标记基因绘制不同阶段的细胞类型来重建T细胞的发育路线。通过结合胸腺TCR-seq、scRNA-seq和ST-seq数据观察到TCR克隆大小≥3的T细胞通常富集在髓质区域，而克隆大小为1的T细胞主要在皮质区域。并且揭示了四种占优势的TCRγ-T细胞亚群，同时使用单细胞数据分析证实了这四个T细胞亚群的存在。然后研究者使用TSO-Hismap追踪胸腺ST切片上四个T细胞亚群的空间定位，显示了从远端皮质到髓质中心点的四个T细胞亚群的定位趋势，测量了四种T细胞亚群的代表区域到髓质中心的距离。进一步还分析了每个亚组的六个zui显著富集的生物过程以及不同年龄组的四种T细胞亚群丰度的动态变化。这些结果对了解其生物学过程和发育特征具有很高的价值。
鉴于T细胞发育与TCR库以及TCR多样性之间的密切关系，研究者观察到TCRα和TCRβ链的四种T细胞亚群中VJ基因表达的明显偏差，并且展示了VJ基因在四种T细胞亚群中的偏好性。由于αβ T细胞成熟是一个跨越多个中间状态的连续分化过程，研究者基于RNA速度，特别是TRAV基因的特征评分，将DP_re细胞重新聚类为4个亚组进行分析。为了更系统地了解αβT细胞的分化模式，对所有T细胞进行了伪时间分析，分析了在T细胞分化伪时间内的代表性基因并且展示了不同阶段T细胞数量的累积分布曲线。随后，努力追踪这些克隆细胞的命运，揭示了这些细胞在各阶段du特而连贯的发育轨迹。最后总结了四种T细胞亚群的发育时间和特征，以描述αβ T细胞的发育。
研究结论：
本研究通过整合空间转录组学和单细胞多组学分析，揭示了人类胸腺细胞的空间组织和发育过程。研究者开发了TSO-his算法来确定胸腺切片中的髓质-皮质区域，划分胸腺小叶，并测量基因表达或细胞丰度随空间距离的变化。通过这种方法，研究人员能够精确地描绘出胸腺小叶的结构单元，并观察到胸腺细胞类型签名分数随空间距离的动态变化。此外，研究还识别了与空间距离显著共变的基因（DVGs），并利用CellChat工具分析了胸腺细胞亚群间的细胞间通信。这些发现为理解胸腺细胞的发育和功能提供了新的视角。
研究的创新性：
本研究的创新性体现在几个方面：首先，研究者开发了TSO-his算法，这是一种新的方法，可以精确地在空间转录组学切片中确定髓质和皮质区域，以及划分胸腺小叶。其次，该研究整合了空间转录组学和单细胞多组学数据，提供了胸腺细胞发育的全面视图。最后，研究不仅识别了与空间距离显著共变的基因，还分析了胸腺细胞亚群间的细胞间通信，这为理解胸腺细胞的复杂相互作用提供了新的工具和数据。
研究的不足之处：
文章中并未明确指出研究的不足之处，但根据研究内容推测，可能的不足包括：样本数量可能有限，这可能影响结果的普适性；研究主要依赖于算法和计算模型，可能需要更多的实验验证来支持算法的准确性；此外，研究主要集中在胸腺细胞的空间组织和发育，对于胸腺细胞功能和免疫应答的深入机制探讨可能不足，未来研究可以进一步探索这些方面。
研究展望：
后续可能的研究方向包括：扩大样本量，以增强研究结果的统计力和普适性；进行更多的实验验证，以确认TSO-his算法的准确性和可靠性；深入探讨胸腺细胞的功能和免疫应答机制，特别是在不同疾病状态下胸腺细胞的作用；此外，可以探索胸腺细胞亚群间的细胞间通信在免疫发育中的具体作用，以及这些通信如何影响胸腺细胞的成熟和分化。
研究意义：
本研究的理论意义在于提供了一种新的方法来分析胸腺细胞的空间组织和发育，这对于理解胸腺的免疫功能和胸腺细胞的成熟过程至关重要。实践意义方面，这些发现有助于开发新的免疫治疗方法，尤其是在胸腺相关疾病和免疫缺陷的治疗中。此外，通过揭示胸腺细胞亚群间的通信网络，本研究为设计针对特定免疫细胞的靶向治疗策略提供了理论基础。
